鞠鑫 錢瑋 胡翠英 馬雪香 王桃云 郭偉強(qiáng)

摘要?[目的]從人參中找尋具有抗腫瘤活性的內(nèi)生菌，并研究其抗腫瘤效果和機(jī)制。[方法]使用假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行分離，通過16s rDNA分子鑒定，采用MTT比色法、western blot等在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231胞系中檢測抗腫瘤活性。[結(jié)果]所分離菌株G13476經(jīng)BLAST比對，確定其為假單胞菌;MTT數(shù)據(jù)和western blot結(jié)果顯示，菌株G13476通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax實(shí)現(xiàn)對三陰性乳腺癌的抑制。[結(jié)論]該研究結(jié)果為人參內(nèi)生假單胞菌G13476在抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?人參;內(nèi)生菌;假單胞菌;分離篩選;抗腫瘤;三陰性乳腺癌

中圖分類號?R?284文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.056

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and Anti?tumor Effect of Endophytic Pseudomonad G13476 in Ginseng

JU Xin，QIAN Wei，HU Cui?ying et al?（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou，Jiangsu 215009）

Abstract?[Objective]The research aimed to find endophytic bacteria with anti?tumor activity from ginseng and study its anti?tumor effect and mechanism.[Method]Pseudomonas basal culture medium was used for isolation，molecular identification was analyzed by 16s rDNA，the anti?tumor effect and mechanism were measured by MTT assay and western blot in MDA?MB?231 cells.[Result]The isolated strain G13476 was aligned by BLAST to determine that it was pseudomonas;MTT data and western blot results showed that strain G13476 inhibited triple?negative breast cancer by down?regulating Bcl?2 and up?regulating Bax.[Conclusion]The results of this study provide technical support and theoretical basis for the development and application of anti?tumor drugs by pseudostellaria genus G13476.

Key words?Ginseng;Endophytic bacteria;Pseudomonad;Isolation and screening;Anti?tumor;Triple?negative breast cancer

癌癥嚴(yán)重危害人民群眾身體健康，如肺癌、肝癌、乳腺癌等。乳腺癌是十大惡性腫瘤之一，尤以三陰性乳腺癌危害更重[1]。目前，三陰性乳腺癌因缺少合適的治療靶點(diǎn)，致使治療效果差、死亡率高[2]。因此，找尋新的抗癌藥物一直是研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

人參，屬五加科植物，在我國有數(shù)千年的藥用歷史，是傳統(tǒng)名貴藥材。人參具有調(diào)氣血、安精神、止驚悸等功效。近年來，現(xiàn)代藥理擴(kuò)大人參的應(yīng)用范圍和價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)人參具有抗腫瘤、抗炎癥、抑菌等作用[3-4]。人參皂苷Rg1通過抑制AMPK/mTOR/PI3K通路減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞的自噬現(xiàn)象[5];人參皂苷Rg3下調(diào)胰島素一號增長因子的分泌，實(shí)現(xiàn)對骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制[6];人參皂苷Re在人永生化表皮細(xì)胞HaCaT中，能夠調(diào)控絲蛋白和半胱天冬酶-14（caspase-14）促進(jìn)皮膚的保護(hù)功能[7];人參皂苷Rh2在結(jié)腸癌荷鼠抑制瘤模型中能夠減輕腫瘤相關(guān)抑郁癥狀[8]。

內(nèi)生菌（endophyte）是一類可在植物體內(nèi)生存的微生物，且對宿主植物友好，不造成任何傷害。內(nèi)生菌因其次生代謝產(chǎn)物中可能含有與宿主植物相同或相似的活性成分，而成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[9]。因此，筆者研究從人參內(nèi)生菌中分離的一株假單胞菌在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中的抗腫瘤活性和潛在作用機(jī)制，以期為以該菌為基礎(chǔ)開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)和試驗(yàn)支撐。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

新鮮人參購自安徽亳州中藥市場;MDA-MB-231細(xì)胞株為蘇州科技生物實(shí)驗(yàn)中心保存;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;細(xì)菌總DNA提取試劑盒、Taq酶購自天根生化科技（北京）有限公司;引物合成、基因測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、乙酸乙酯等試劑購自國藥集團(tuán)。

假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基：明膠胨 16.0 g、蛋白胨 10.0 g、硫酸鉀 10.0 g、氯化鎂 1.4 g、溴化十六烷基三甲胺 0.2 g、瓊脂粉15 g，雙蒸水定容至1 L，pH調(diào)節(jié)至7.2，121℃滅菌20 min。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?人參表面消毒及培養(yǎng)。

新鮮人參根莖經(jīng)由自來水沖洗后，用50%乙醇處理15 s，75%乙醇處理30 s。隨后，將人參于1% NaClO溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗3～5次，收集沖洗廢液。將人參根莖剪成5 mm的小段置于固體假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于隔水式干燥培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)14 d左右。隨后，進(jìn)行單菌落分選。

1.2.2?人參內(nèi)生細(xì)菌總DNA提取和16s rDNA擴(kuò)增。

將所分離的單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，28 ℃，100 r/min培養(yǎng)3 d后，10 000 r/min離心1 min后，在菌體沉淀中加入200 μL緩沖液GA和20 μL蛋白酶K，振蕩;加入220 μL緩沖液GB，振蕩15 s后70℃水浴10 min;加入220 μL無水乙醇，振蕩15 s，轉(zhuǎn)至吸附柱中，隨后按說明書進(jìn)行操作。使用紫外微量分光光度計(jì)檢測所提DNA的濃度和質(zhì)量。

以所提DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR擴(kuò)增體系如下：2.0 μL 10×Taq Buffer（with Mg2+），1.5 μL 10 mmo/L dNTPs，0.5 μL 10 mmol/L 27F，0.5 μL 10 mmol/L 1492R，0.2 μL Taq酶，1.5 μL模板DNA，加無菌水補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。所回收的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3?次生代謝產(chǎn)物提取。收集上述假單胞菌培養(yǎng)液5 L，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，得到粗提物，稱重后，-20 ℃保存。

1.2.4?MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)及MTT活力檢測。

MDA-MB-231細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于96孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)量為3×103個(gè)/100 μL。加入不同濃度粗提物（DMSO溶解），終濃度為0、0.5、2、8、32 μg/mL，每濃度設(shè)置3個(gè)平行孔。37 ℃、5% CO2下分別培養(yǎng)24、48 h后，棄上清，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，加入100 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀于570 nm處測定吸光度。

1.2.5?Western blot檢測Bcl-2、Bax等相關(guān)蛋白含量變化。

取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板中，根據(jù)MTT比色結(jié)果，選擇32 μg/mL的粗提物進(jìn)行刺激。刺激24 h后，提取總蛋白，經(jīng)BCA定量后，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，

分別加入一抗（Bcl-2、Bax和GAPDH）4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影。

2?結(jié)果與分析

2.1?人參內(nèi)生假單胞菌G13476的分離與鑒定

人參表面經(jīng)無菌處理后，經(jīng)涂布分析顯示滅菌徹底。使用假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分離單菌落G13476。提取該菌的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條大小約1 500 bp的特異性DNA片段，與細(xì)菌的16s rDNA長度一致（圖1）。此片段經(jīng)回收和測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，表明菌株G13476屬假單胞菌屬（圖2）。

2.2?菌株G13476抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長

將菌株G13476進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，經(jīng)乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥濃縮，獲得干粉，DMSO溶解，調(diào)整濃度至10 mg/mL。

由圖3可見，菌株G13476粗提取對MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制率增加，且隨著作用時(shí)間的延長，抑制率也隨之增加。在作用24 h，2 μg/mL粗提取的抑制率約為 35%，32 μg/mL粗提取的抑制率約為51%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株G13476對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有較好的抑制增殖作用。

2.3?菌株G13476調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白含量

由圖4可知，菌株G13476粗提物可有效抑制Bcl-2蛋白含量，同時(shí)提升Bax的蛋白含量，且10 μg/mL的調(diào)控效果明顯優(yōu)于2 μg/mL。結(jié)果表明，菌株G13476可通過調(diào)控Bcl-2和Bax顯示抗腫瘤作用。

3?結(jié)論與討論

該研究以人參為對象，從中分離假單胞菌株G13476，并在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中檢測其抗腫瘤效果。結(jié)果表明，假單胞菌株G13476具有較好的抗腫瘤活性，終濃度32 μg/mL的G13476粗提物的抑制率為51%。

人參被稱為“百草之王”，藥用價(jià)值廣泛，現(xiàn)代藥理研究顯示，人參具有抗腫瘤、抗炎癥、增加免疫力等作用。但因價(jià)格、蟲害等因素阻礙了人參的應(yīng)用及推廣。近年來，隨著對內(nèi)生菌研究的深入，人參內(nèi)生菌中含有與人參功效相似的次生代謝產(chǎn)物，使其人參內(nèi)生菌成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。田磊等[10]從人參內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株具有較為ACC脫氫酶活性的熒光假單胞桿菌;王卓等[11]發(fā)現(xiàn)2種人參內(nèi)生真菌——GS-4和GS-22，其乙酸乙酯粗提物對人宮頸癌Hela細(xì)胞具有抑制作用，其半抑制濃度達(dá)60～140 μg/mL，這2種真菌分別屬于半裸鐮刀菌和半球菌。雖然有關(guān)人參內(nèi)生菌的抗腫瘤活性和分離篩選研究較多，但有關(guān)內(nèi)生假單胞菌的篩選和抗腫瘤活性研究較少。

乳腺癌是排位第一的女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來出現(xiàn)升高且年輕化趨勢。三陰性乳腺癌是乳腺癌中較為特殊的一種類型，其雌激素受體、孕激素受體、HER-2受體均為陰性，因缺乏合適的治療靶點(diǎn)，導(dǎo)致其死亡率高于其他類型。因此，找尋乳腺癌（特別是三陰性乳腺癌）的新型治療藥物或手段成為研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)[12-13]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，蒲公英提取物對三陰性乳腺癌細(xì)胞具有良好的抑制效果[14];中藥西黃丸可有效抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞株Hs578T的增殖[15]。該研究以三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為受測細(xì)胞，采用MTT比色法分析所分離的假單胞菌株G13476的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，菌株G13476具有較好的抗三陰性乳腺癌活性。

B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），是較早開展研究的腫瘤相關(guān)蛋白。其中Bcl-2是一種原癌基因，位于t（14∶18）染色體異位斷裂處，其具有抗氧化、抑制凋亡等方面作用;Bax是一種促凋亡蛋白，其通過自身形成同源二聚體，進(jìn)而破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活caspase的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，Bcl-2長久以來被認(rèn)為是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[16-17]。傅思瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯可有效降低侵潤性乳腺癌中Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bax蛋白含量。該研究結(jié)果顯示，人參內(nèi)生假單胞桿菌G13476可通過下調(diào)Bcl-2蛋白含量、上調(diào)Bax蛋白含量，實(shí)現(xiàn)對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抑制。

綜上所述，該研究從人參中分離獲得一株具有抗腫瘤活性的菌株G13476，經(jīng)鑒定為假單胞桿菌屬，并在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物可通過調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白，實(shí)現(xiàn)抑制作用。該結(jié)果為人參內(nèi)生菌在抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

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