武廣珩，謝其婷，呂橄，林志鑾,，王飛權(quán)，任宇紅，張傳海*

(1 福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術重點實驗室，福建 武夷山 354300；2 武夷學院生態(tài)與資源工程學院，福建 武夷山 354300；3 中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 武夷山 354300；4 華東理工大學生物工程學院/生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

我國的飲茶歷史很長，產(chǎn)于福建省北部、武夷山地區(qū)的武夷巖茶，香高馥郁、滋味醇厚滑潤，屬于半發(fā)酵的青茶，是閩北烏龍茶的代表、中國十大名茶之一，也是烏龍茶的始祖[1]。武夷巖茶亦是所有茶類中工序最多、最復雜的茶類，一般制作工序為：采摘、萎凋、做青(發(fā)酵)、殺青、揉捻、烘干、挑揀、毛茶、初焙(走水)、退火、復焙、成茶(精茶)[2]。水仙和肉桂是武夷巖茶產(chǎn)區(qū)中的2個主要品種[3]。肉桂茶的香氣猶如桂皮，茶湯色彩橙黃清澈，回甘醇厚濃郁；水仙茶湯有淡淡的花果香味，顏色比較清澈透亮[4]。瑞香屬于中生高香品種，是從黃旦雜交后代中選育而來，茶湯香氣馥郁高揚，花果香較母本更為顯著，最大的特色是滋味不苦不澀且甘潤醇厚[5-6]。

茶葉的加工過程中，影響茶葉香氣的幾種重要酶類有：β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，BG)、β-櫻草糖苷酶(beta-primroseglucosidase，BP)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。鄧慧莉等[7]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)香氣的前體是以β-葡萄糖苷的形式而存在的，而β-葡萄糖苷酶促使這些香氣前體的釋放。陳壽松等[8]發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的基因相對表達量與香氣前體物質(zhì)的物質(zhì)總量及糖苷類成分的變化成正相關性。多酚氧化酶是決定茶葉品質(zhì)的重要酶類之一，它不僅影響茶樹的生理代謝，也影響著制作成茶的過程中多酚類物質(zhì)的氧化程度，紅茶中的茶紅素和茶黃素是通過多酚氧化酶的酶促作用形成[9]?？箟难徇^氧化物酶是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，又是維生素C代謝的主要酶類，在福鼎大白茶在萎凋的過程中，APX基因的表達量隨著萎凋時間的延長呈現(xiàn)出“升高—降低—再升高—再降低”的變化特點[10]。

影響茶葉品質(zhì)的內(nèi)因有茶葉品種本身的內(nèi)含物、加工過程中的酶活性變化和酶基因的表達差異等；外因有溫度、濕度、光照、土壤、茶葉的采制技術等。本論文通過研究武夷巖茶主打品種肉桂、水仙、瑞香鮮葉香氣相關酶基因的表達差異，對影響茶品質(zhì)內(nèi)因方面展開探討，為加工品質(zhì)更優(yōu)的茶葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月20日—5月15日，武夷學院茶樹種質(zhì)資源圃的肉桂、水仙、瑞香新鮮嫩芽葉片。采摘標準：一芽二葉，采樣后用液氮預冷處理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用Eastep Super總RNA提取試劑盒(Promega)提取肉桂、水仙、瑞香新鮮嫩芽葉片總RNA，用微量核酸檢測儀(Eppendorf BioPhotometer Plus)檢測RNA樣品質(zhì)量和濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其清晰度與完整性，保存于-80 ℃冰箱(SANYO MDF-682)備用。采用GoScriptTMReverse Transcription Mix(Promega)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體使用步驟見說明書。

1.2.2 基因克隆及序列分析

根據(jù)NCBI已登錄的過氧化物酶和多酚氧化酶序列(登錄號：JQ740734.1和AY659975.1)，分別設計過氧化物酶基因(CsAPX)和多酚氧化酶基因(CsPPO)的引物(表1)。PCR反應采用25 μL體系：TaKaRa Ex Taq PCR反應體系；反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s；按52 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；產(chǎn)物4 ℃保存。所有的PCR產(chǎn)物均用1%凝膠電泳，然后將目標片段的PCR產(chǎn)物按照UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海生工)回收目的基因條帶，并委托上海生工進行序列測定。

表1 用于克隆茶樹過氧化物酶和多酚氧化酶基因cDNA片段的引物序列Tab.1 Primer cDNA pairs for amplifying polyphenol oxidase and peroxidase genes

1.2.3 熒光定量PCR分析

使用實時定量PCR儀(Bio-rad Connect 96)進行擴增，SYBR Green試劑盒為SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)，反應程序為:95 ℃預變性90 s，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。以茶樹18S rRNA為內(nèi)參，根據(jù)1.2.2得到的香氣相關酶CsAPX和CsPPO基因序列設計引物和已經(jīng)報道的CsBG1、CsBP及18S rRNA基因引物序列進行表達量分析[11]，見表2。

表2 用于實時定量PCR的引物序列Tab.2 Primer sequences of Real-time PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列檢索比對?；虻南鄬Ρ磉_量，使用Excel 2007和One-way ANOVO對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉總RNA的提取

用肉桂、水仙、瑞香3個樣品的新鮮葉片提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠快速電泳檢測。從圖1中可知，3個樣品肉桂、水仙、瑞香總RNA電泳圖譜帶型清晰、條帶完整，有3個條帶，提取結(jié)果較為理想。經(jīng)RNA濃度測定后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)實驗。

2.2 CsAPX和CsPPO基因的擴增

為了擴增武夷巖茶中過氧化物酶和多酚氧化酶的目的基因，選取其中的水仙、肉桂和瑞香的cDNA為模板，進行了基因片段的PCR擴增，并獲得對應的條帶(圖2)。PCR所需引物(表1)根據(jù)NCBI已登錄的過氧化物酶和多酚氧化酶序列(登錄號：JQ740734.1和AY659975.1)設計。測序發(fā)現(xiàn)，3個品種的CsAPX基因編碼431個氨基酸，CsPPO基因編碼575個氨基酸；CDS序列間僅存在個別的SNP差異。

M—DL2000 DNA標記；1—瑞香；2—水仙；3—肉桂。圖1 茶樹總RNA的電泳圖Fig.1 Total RNA extraction of tea plant

A—CsAPX PCR擴增；B—CsPPO PCR擴增；M—DNA標記；1—水仙；2—肉桂；3—瑞香。圖2 克隆茶樹過氧化物酶和多酚氧化酶基因片段Fig.2 PCR amplification of polyphenol oxidase and peroxidase gene from tea plant

2.3 實時熒光定量分析

為了明確實驗中4對基因?qū)崟r定量PCR引物的可靠性，以水仙的cDNA作為模板進行了PCR檢測。從圖3可看出，第2～5泳道4條明亮程度和大小不一的擴增條帶。之后，以肉桂、水仙、瑞香3個樣品的cDNA為模板，以表2中的序列為引物，進行qPCR。結(jié)果表明，品種水仙和瑞香的鮮葉中CsPPO基因的表達量很低，肉桂中的表達量比18S rRNA低，但顯著高于水仙和瑞香(圖4 A)；肉桂鮮葉中幾乎不表達CsBP基因，但水仙與瑞香中均有表達，且水仙中的表達量要明顯多于瑞香(圖4B)；肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG1的表達，但瑞香中的表達最多，水仙次之，肉桂最少(圖4C)；CsAPX在3個茶葉品種中也都有表達，且肉桂和水仙中的表達量相當，瑞香較少(圖4D)。

M—DL2000 DNA標記；1—rt-Cs18S；2—rt-CsAPX；3—rt-CsBG1；4—rt-CsBP；5—rt-CsPPO。圖3 茶樹中基因表達引物的檢測Fig.3 Detection of primers for gene expression in tea plants

不同的字母代表顯著性差異(P<0.01，one way ANOVA)。圖4 不同茶樹鮮葉中香氣相關酶的基因表達模式分析Fig.4 Real-time analysis of expression levels of aroma related genes

3 結(jié)論與討論

研究[12]表明，在綠茶的加工過程中，由于多酚氧化酶的活力略有上升，使得兒茶素被氧化，減輕了兒茶素的苦澀味；兒茶素氧化過程中產(chǎn)生的鄰醌與蛋白質(zhì)分解后的氨基酸作用后形成甜香味。本研究中，肉桂鮮葉中CsPPO的表達量明顯高于水仙和瑞香，所以肉桂沖泡的茶湯會比水仙和瑞香的茶湯更加濃郁，回甘更加醇厚。

β-櫻草糖苷酶對于茶葉而言，其主要作用是通過水解萜醇類糖苷香氣前體，使茶葉呈現(xiàn)出天然花香[7]。CsBP在水仙鮮葉中的表達量比瑞香更多，但二者都顯著高于肉桂，故水仙沖泡的茶湯中天然花香最為濃郁，瑞香次之。

在茶葉的加工過程中，β-葡萄糖苷酶可以促進糖苷類香氣前體的水解并釋放出揮發(fā)性糖苷，為茶葉香氣成分的積累提供物質(zhì)基礎，從而可增加茶葉的香氣[13]。結(jié)果顯示肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG的表達，但瑞香中的含量最多，故而瑞香茶湯的茶香味更濃。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)在紅茶加工中，可以將某些黃烷醇類物質(zhì)經(jīng)過氧化作用形成茶黃素，而茶黃素又能迅速經(jīng)氧化聚合作用形成復雜的茶紅素類物質(zhì)，茶紅素在成品茶的褐色方面起到了重要的作用[14]。CsAPX基因的表達在3個品種中都有存在，且肉桂和水仙中的表達量相當，但瑞香中的含量相比之下較少。因此，在茶湯色澤方面，相同的焙火條件，肉桂和水仙的顏色較瑞香會更深；同時由于肉桂鮮葉中CsPPO的表達量明顯高于水仙，所以在CsAPX和CsPPO基因的雙重作用下，肉桂茶湯最深，水仙次之。

綜上所述，本研究的結(jié)論與人們?nèi)粘Ｔ跊_泡相同加工工藝、相同品牌的肉桂、水仙、瑞香所產(chǎn)生的認知一致，為今后選擇茶葉鮮葉用于后期加工提供了理論支持。