黨建中 涂亞芳 王 娟 楊英杰

糖尿病腎臟病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，目前臨床尚無特效治療方法，所以研究者們一直在尋求DKD新的治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者機(jī)體氧化應(yīng)激水平顯著增高，通過抗氧化應(yīng)激治療可抑制糖尿病神經(jīng)病變、心臟病、腎臟病等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[1-3]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)因其刺激紅細(xì)胞生成作用，臨床上廣泛應(yīng)用于腎性貧血和腫瘤化療相關(guān)貧血的治療。然而，最近在一些非紅系細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了EPO受體(EPOR)的表達(dá)，例如施旺細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，且給予外源性EPO可以對上述細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[4-6]。既往研究多認(rèn)為EPO主要通過抗細(xì)胞凋亡機(jī)制來發(fā)揮非血液學(xué)組織保護(hù)作用，但近來有觀點(diǎn)認(rèn)為單獨(dú)的抗凋亡效應(yīng)不能完全解釋EPO的非血液學(xué)組織保護(hù)效應(yīng)[7]。已有研究證實(shí)EPO及其衍生物可通過改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)揮組織保護(hù)作用，EPO及其衍生物的抗氧化應(yīng)激作用逐步受到關(guān)注[7]。一些臨床研究還發(fā)現(xiàn)EPO治療可降低透析患者血漿氧化應(yīng)激水平[8-9]，但EPO及其衍生物能否抑制DKD時腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮腎臟保護(hù)作用目前還不清楚。本研究通過鏈脲菌素腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激及腎臟病變情況，探究EPO衍生肽ARA290能否抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激及腎臟損傷。

材料與方法

實(shí)驗材料

實(shí)驗動物 選擇7～8周齡，體重180～200g,SPF級健康SD雄性大鼠進(jìn)行研究，實(shí)驗動物由湖北省實(shí)驗研究動物中心提供[合格證號scxk(鄂)2015-0018]。

主要試劑 ARA290(美國CSNpharm)，EPOR、CD131、β-actin抗體(美國Santa Cruz)，丙二醛(MDA)抗體(武漢艾美捷)，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)抗體(美國Abbiotec)，尿白蛋白ELISA 檢測試劑盒(武漢貝茵萊)，尿肌酐ELISA 檢測試劑盒(武漢貝茵萊)，活性氧(ROS) ELISA 檢測試劑盒(上海江萊)。

實(shí)驗方法

動物模型制備及分組 24只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇18只禁食后，一次性腹腔注射60 mg/kg鏈脲菌素制備糖尿病大鼠模型。72h后斷尾采血測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠成功模型。將18只造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM組)6只：皮下注射生理鹽水0.5 ml,隔日1次；糖尿病模型+ARA290 50 U/kg治療組(DA1組)6只：皮下注射ARA290，50 U/kg，隔日1次；糖尿病模型+ARA290 100 U/kg治療組(DA2組)6只：皮下注射ARA290，100 U/kg，隔日1次。同時設(shè)立正常對照組(NC組)6只，皮下注射生理鹽水0.5 ml,隔日1次。高鹽高脂飲食飼養(yǎng)12周處死大鼠，心臟取血收集血標(biāo)本，腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片行PAS、免疫熒光及免疫組化檢測，部分腎組織保存于-70℃冰箱，待行Western印跡不相關(guān)檢測。

一般指標(biāo)檢測 根據(jù)試劑盒說明采用ELISA法檢測大鼠尿白蛋白和肌酐，計算尿白蛋白/尿肌酐(ACR)。尿β2微球蛋白(β2-MG)、血糖采用全自動生化檢測，紅細(xì)胞比容(Hct)采用自動化血液分析儀檢測，尾套法測定大鼠尾動脈收縮壓。

病理學(xué)觀察 腎組織石蠟切片行常規(guī)PAS染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理變化。每張切片隨機(jī)取20個正切的腎小球，系膜區(qū)面積占腎小球毛細(xì)血管叢面積的百分比用Image-pro plus 6.0軟件分析計算。

ROS檢測 腎組織冰上研磨制成組織勻漿，離心后取上清，根據(jù)試劑盒說明采用ELISA法檢測大鼠腎臟ROS水平。

免疫熒光 石蠟切片常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)，滴加EPOR、CD131抗體，4℃過夜。翌日滴加 FITC標(biāo)記的二抗，熒光顯微鏡觀察攝像，Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，以平均吸光度表示陽性物質(zhì)的相對含量。

免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)，滴加MDA、8-OHdG抗體，4℃過夜。翌日滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。MDA和8-OHdG陽性細(xì)胞呈棕黃色，用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，以平均吸光度表示陽性物質(zhì)的相對含量。

實(shí)時定量PCR(RT-PCR) 用TRIzol法提取腎臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測。NOX4引物：上游5′- T￣G￣T￣A￣A￣C￣A￣G￣A￣G￣G￣G￣A￣A￣A￣A￣C￣A￣G￣T￣T￣G￣G￣A-3′，下游5′-G￣T￣T￣C￣C￣G￣G￣T￣T￣A￣C￣T￣C￣A￣A￣A￣C￣T￣A￣T￣G￣A￣A￣G￣A￣G-3′；β-actin引物：上游5′-A￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣A￣C￣G￣T￣A￣G￣C￣C￣A￣T￣C￣C-3′，下游5′-T￣C￣T￣C￣A￣G￣C￣T￣G￣T￣G￣G￣T￣G￣G￣T￣G￣A￣A￣G-3′。實(shí)驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

Western印跡 提取腎組織總蛋白，取50 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后加入NOX4、β-actin抗體進(jìn)行雜交過夜。翌日滴加HRP標(biāo)記的二抗雜交，曝光成像后用Gel-Pro圖像分析系統(tǒng)分析吸光度。

免疫共沉淀 用IP裂解液裂解腎組織，收取上清蛋白。蛋白質(zhì)中加入30 μl瓊脂糖蛋白A+G預(yù)處理，消除非特異性結(jié)合。然后去除Agarose protein A+G，加Co-IP抗CD131 抗體到500 μl總蛋白中，與目標(biāo)蛋白反應(yīng)，4℃過夜。翌日加30 μl瓊脂糖蛋白A+G 4℃緩慢搖動3h，離心后棄上清，溶于適量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液中，用于后續(xù)Western印跡檢測。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用《SPSS 22.0》進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

ARA290對糖尿病大鼠尿ACR、β2-MG及Hct、血壓、血糖的影響與NC組相比，DM組尿ACR、β2-MG顯著增高。與DM組相比，ARA290治療組尿ACR、β2-MG降低，且高劑量ARA290治療組尿ACR、β2-MG下降更明顯。DM組及不同劑量ARA290治療組Hct、尾動脈收縮壓、血糖均無顯著差異 (圖1)。

圖1 各組大鼠一般指標(biāo)ACR：尿白蛋白/尿肌酐；β2-MG：尿β2微球蛋白；Hct：紅細(xì)胞比容；SBP：尾動脈收縮壓；NC：正常對照組；DM：糖尿病模型組；DA1：糖尿病模型+ARA290 50 U/kg治療組；DA2：糖尿病模型+ARA290 100 U/kg治療組；a:與NC組比較，P<0.05;b:與DM組比較，P<0.05;c:與DA1組比較，P<0.05

腎臟EPOR和CD131表達(dá)免疫熒光顯示各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小球均表達(dá)EPOR和CD131，且主要表達(dá)于胞膜，兩者在大鼠腎臟內(nèi)存在共定位表達(dá)。與NC組相比，DM組腎臟EPOR、CD131表達(dá)增高。與DM組相比，ARA290治療組腎臟EPOR、CD131表達(dá)降低。采用抗CD131抗體行免疫沉淀后行Western印跡可檢出EPOR，表明EPOR和CD131在大鼠腎臟內(nèi)存在相互結(jié)合(圖2、3)。

圖2 各組大鼠腎臟EPOR、CD131的表達(dá)(IF,×400)A：免疫熒光檢測EPOR、CD131表達(dá)；B：EPOR、CD131半定量分析；NC：正常對照組；DM：糖尿病模型組；DA1：糖尿病模型+ARA290 50 U/kg治療組；DA2：糖尿病模型+ARA290 100 U/kg治療組；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；a:與NC組比較，P<0.05;b:與DM組比較，P<0.05

圖3 大鼠腎臟EPOR、CD131的表達(dá)(免疫共沉淀)NC：正常對照組；Input:陽性對照；IgG：陰性對照；IP：免疫沉淀；IB：免疫印跡;EPOR:促紅細(xì)胞生成素受體

ARA290改善糖尿病大鼠腎臟病理改變腎臟PAS染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組腎小球體積增大，毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多，系膜面積占毛細(xì)血管叢面積百分比增加，腎小管部分上皮細(xì)胞空泡變性、刷狀緣脫落。ARA290治療后糖尿病大鼠上述腎臟病理改變減輕(圖4)。

ARA290抑制糖尿病大鼠腎臟NOX4表達(dá)RT-PCR和Western印跡檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組腎臟NOX4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高。與DM組相比，ARA290治療組腎臟NOX4表達(dá)降低，且高劑量ARA290治療組NOX4表達(dá)降低更顯著(圖5)。

ARA290抑制糖尿病大鼠腎臟ROS產(chǎn)生與NC組相比，DM組腎臟ROS水平顯著增高。與DM組相比，ARA290治療組腎臟ROS水平降低,且高劑量ARA290治療組腎臟ROS下降更明顯。高劑量ARA290治療組腎臟ROS水平較DM組降低了54%(圖5)。

圖4 各組大鼠腎臟病理改變(PAS，×400)A～D：與NC組相比，DM組腎小球體積增大，毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多，腎小管部分上皮細(xì)胞空泡變性、刷狀緣脫落。與DM組相比，DA1、DA2組上述腎臟病理改變減輕；E：腎小球系膜面積/毛細(xì)血管叢面積；NC：正常對照組；DM：糖尿病模型組；DA1：糖尿病模型+ARA290 50 U/kg治療組；DA2：糖尿病模型+ARA290 100 U/kg治療組；a：與NC組比較，P<0.05;b：與DM組比較，P<0.05;c：與DA1組比較，P<0.05

ARA290降低糖尿病大鼠腎臟MDA及8-OHdG水平免疫組化結(jié)果顯示，DM組MDA、8-OHdG陽性細(xì)胞分布于腎小球及腎小管間質(zhì)。與NC組相比，DM組腎臟MDA及8-OHdG表達(dá)顯著增高。與DM組相比，ARA290治療組腎臟MDA及8-OHdG表達(dá)降低(圖6)。

圖5 各組大鼠腎臟NOX4、ROS表達(dá)水平A：NOX4 mRNA相對表達(dá)量；B、C：NOX4蛋白相對表達(dá)量；D：ROS含量；NOX4：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷氧化酶4；ROS：活性氧；a：與NC組比較，P<0.05;b：與DM組比較，P<0.05;c：與DA1組比較，P<0.05

圖6 各組大鼠腎臟MDA、8-OHdG表達(dá)水平(IH，×400)A：免疫組化檢測MDA、8-OHdG表達(dá)；B：MDA、8-OHdG半定量分析；NC：正常對照組；DM：糖尿病模型組；DA1：糖尿病模型+ARA290 50 U/kg治療組；DA2：糖尿病模型+ARA290 100 U/kg治療組；MDA：丙二醛；8-OHdG：8-羥基脫氧鳥苷；a：與NC組比較，P<0.05;b：與DM組比較，P<0.05;c：與DA1組比較，P<0.05

討 論

EPO主要由成人腎臟Ⅰ型間質(zhì)細(xì)胞分泌，鑒于EPO主要分泌細(xì)胞與腎臟的解剖學(xué)關(guān)系，我們有理由相信EPO在腎臟內(nèi)更有利于發(fā)揮其內(nèi)分泌或旁分泌作用。此外，在一些糖尿病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，不管患者是否合并貧血，其血漿EPO水平較低[10-11]。這提示糖尿病患者往往存在著EPO生成或應(yīng)答受損，為給予糖尿病患者外源性EPO治療提供了理論依據(jù)。然而，為了研究EPO的非血液學(xué)組織保護(hù)作用，大劑量的EPO制劑已用于臨床研究和動物實(shí)驗。由于EPO對骨髓系統(tǒng)過度刺激，部分研究在取得一定療效的同時也帶來了血栓栓塞等一系列并發(fā)癥。為了避免大劑量EPO治療帶來的血栓生成等副作用，研究者們一直致力尋求將EPO造血作用和非血液學(xué)組織保護(hù)作用分開的EPO衍生物。通過模擬EPO的helix B結(jié)構(gòu)，研究者們合成了最新的EPO衍生肽——ARA290。ARA290具有與EPO相同的組織保護(hù)效應(yīng)，同時無造血活性。目前，已有研究報道ARA290可通過抗氧化機(jī)制對心臟、大腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽高脂飲食飼養(yǎng)3個月后，糖尿病大鼠出現(xiàn)尿ACR、β2-MG增加，腎小球體積增大、細(xì)胞外基質(zhì)增多等早期DKD腎臟病變表現(xiàn)，而ARA290治療抑制了ACR增加等上述病變，同時對糖尿病大鼠的Hct、血壓、血糖無明顯影響。這證實(shí)了ARA290可對早期的DKD大鼠發(fā)揮非血液學(xué)的腎臟保護(hù)作用。

糖尿病時的高血糖狀態(tài)下，腎臟的足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等固有細(xì)胞可產(chǎn)生過量ROS，導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激水平增高。過量的ROS可直接氧化損傷核酸、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，使其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。此外，ROS還可作為信號分子，激活一系列細(xì)胞應(yīng)激敏感性通路導(dǎo)致細(xì)胞損傷。目前的研究認(rèn)為，NADPH氧化酶是DKD時腎臟ROS的關(guān)鍵來源，所以在本研究中我們檢測了NADPH氧化酶在腎臟主要亞型NOX4的表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，DM組大鼠腎臟NOX4表達(dá)顯著增高，ROS產(chǎn)物增多。ARA290治療后，糖尿病大鼠腎臟NOX4表達(dá)降低，ROS產(chǎn)物減少。此外，我們還檢測了反映腎臟脂質(zhì)和DNA氧化損傷的指標(biāo)MDA和8-OHdG。結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠腎臟MDA和8-OHdG均增高。經(jīng)ARA290治療后，糖尿病大鼠腎臟MDA和8-OHdG水平降低。這證實(shí)ARA290可通過抑制NOX4的表達(dá)降低腎臟ROS的產(chǎn)生，抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腎臟損傷。

在血液系統(tǒng)，EPO可通過經(jīng)典的EPOR2同二聚體受體介導(dǎo)，調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞bcl-2抗凋亡基因家族相關(guān)基因的表達(dá)，從而維持它們繼續(xù)發(fā)育為成熟的紅細(xì)胞。目前的研究認(rèn)為，EPO及其衍生物發(fā)揮非血液學(xué)組織保護(hù)作用可能需要一種新的組織保護(hù)受體(Tissue protective receptor,TPR)介導(dǎo)，并激活一系列與經(jīng)典的EPOR2同二聚體途徑不同的信號通路，但目前TPR的結(jié)構(gòu)并不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除抑制CD131表達(dá)后EPO的組織保護(hù)作用消失，而對其血液學(xué)效應(yīng)無明顯影響[14]，這提示CD131可能是介導(dǎo)EPO組織保護(hù)作用的TPR的有效構(gòu)成成分。CDl31是I型細(xì)胞因子受體超家族中白細(xì)胞介素3(IL-3)、IL-5、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子受體的共享亞基，具有重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。Ⅰ型細(xì)胞因子受體存在受體亞基共享，而EPO亦屬于Ⅰ型細(xì)胞因子超家族。在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，已有研究證實(shí)EPOR和CD131存在共表達(dá)，且兩者可形成異二聚體，介導(dǎo)EPO的組織保護(hù)作用[14-15]。隨著對 CD131在EPO及其衍生物發(fā)揮非血液學(xué)組織保護(hù)效應(yīng)中潛在作用的認(rèn)識，研究者們推測表達(dá)EPOR的非造血組織可能存在EPOR-CD131蛋白復(fù)合物，在上述組織發(fā)生損傷時作為TPR介導(dǎo)EPO及其衍生物潛在的組織保護(hù)作用。本實(shí)驗中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟表達(dá)EPOR和CD131，且免疫熒光顯示兩者存在共定位表達(dá)。此外，免疫共沉淀也證實(shí)了兩者在腎臟內(nèi)存在相互結(jié)合。這提示腎臟細(xì)胞存在EPOR-CD131蛋白復(fù)合物，ARA290發(fā)揮腎臟保護(hù)作用可能需要通過這一受體系統(tǒng)介導(dǎo)。

總之，本研究證實(shí)ARA290可抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟表達(dá)EPOR、CD131，且兩者在體內(nèi)可形成EPOR-CD131蛋白復(fù)合物，其可能作為TPR介導(dǎo)了ARA290的腎臟保護(hù)作用。