李天萍，于 勇，應(yīng)玉雯，楊雨晴，謝利軍，陳 娟，張宏文，周 辰，孫魯寧*，王永慶*

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京 210029；2 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208

伏立康唑?yàn)樾乱淮娜蝾惪拐婢幬?，其常用于預(yù)防和治療一些與侵襲性真菌感染相關(guān)的疾病[1，2]。然而，由于存在個(gè)體差異和治療窗較窄，伏立康唑可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如視覺(jué)障礙、光敏性、神經(jīng)毒性和肝功能障礙等[3]。伏立康唑及其代謝產(chǎn)物伏立康唑-N-氮氧化物血藥濃度與患者的臨床療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)，監(jiān)測(cè)兩者血藥濃度可提高抗真菌治療的有效性和安全性[4]。伏立康唑-N-氮氧化物是伏立康唑通過(guò)細(xì)胞色素P450（CYP）酶代謝的主要產(chǎn)物，占其代謝物的70%以上。盡管伏立康唑-N-氮氧化物的藥物活性低于伏立康唑，但可以抑制與伏立康唑代謝相關(guān)的CYP450 酶的代謝活性[5]。因此，建立同時(shí)測(cè)定伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度的方法具有重要意義；可用于血藥濃度監(jiān)測(cè)或藥動(dòng)學(xué)研究，以確定和調(diào)整給藥方案。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）和免疫分析法測(cè)定生物樣本中伏立康唑及其代謝物伏立康唑-N-氮氧化物的含量，但定量下限較高，最低僅為0.4 μg·mL-1，最高血藥濃度為1.6μg·mL-1，根據(jù)《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，定量下限大于最高血藥濃度的1/20，不能滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究要求[6]。本研究旨在簡(jiǎn)化分析步驟，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立一種更靈敏、簡(jiǎn)便、可靠的人血漿中兩者同時(shí)定量分析的方法，并將該方法應(yīng)用于伏立康唑藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)100862-201402，純度99.7%，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；伏立康唑-N-氧化物對(duì)照品 （純度99.9%，批號(hào)2352-043A11，由TLC Pharmaceutical Standards 提供）；同位素內(nèi)標(biāo)（伏立康唑-D3、伏立康唑-N-氮氧化物-D3同位素純度分別為98.8%、98.7%，由Toronto Research Chemicals 公司提供）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；氨水為分析純；試驗(yàn)用水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1290 Infinity 高效液相色譜儀（G1316C柱溫箱，G4226A 多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器，G4220A 二元高壓泵）；API 4000（美國(guó)應(yīng)用生物公司）；Analyst?軟件（1.6.3 版本）；BP 211D 電子天平（Sartorius 公司）等。

2 方 法

2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：38 ℃；流動(dòng)相：含0.1%的甲酸（A）和甲醇（B）（梯度洗脫：0～3 min，45%B；3～3.1 min，45%～95%B；3.1～4.5 min，95%B，4.5～4.6 min，95%～45%B；4.6～6.0 min，45%B）；流速：0.6 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：8 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣壓力：344.7 kPa；渦輪氣壓力：413.7 kPa；氣簾氣壓力：275.8 kPa；碰撞氣壓力：41.4 kPa。待測(cè)物伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物及其內(nèi)標(biāo)的化合物參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物及其內(nèi)標(biāo)的化合物參數(shù)

2.2 儲(chǔ)備液與工作溶液的配制

分別精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?、伏立康?N-氮氧化物對(duì)照品適量，用乙腈溶解配制成濃度分別為1.00 mg·mL-1和400 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。

分別精密量取伏立康唑儲(chǔ)備液和伏立康唑-N-氮氧化物儲(chǔ)備液適量，置于同一量瓶中，用0.1%氨水乙腈稀釋成濃度均為160 μg·mL-1的混合工作液。再用0.1%氨水乙腈逐級(jí)稀釋配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線用和質(zhì)控用混合工作液。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液及工作溶液：分別精密稱取伏立康唑-D3對(duì)照品、伏立康唑-N-氮氧化物-D3對(duì)照品適量，用乙腈溶解，分別配制成濃度均為125 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。分別精密量取伏立康唑-D3儲(chǔ)備液和伏立康唑-N-氮氧化物-D3儲(chǔ)備液適量，置于同一量瓶中，用乙腈稀釋成30 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線用與質(zhì)控用樣本的配制

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，加入50 μL 空白血漿，再分別加入2.5 μL 相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線用或質(zhì)控用混合工作液，渦旋10 s，混勻，配制成含伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度分別為10.0、20.0、50.0、200、500、2000、3600、4000、7000、8000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線用及濃度分別為10.0、25.0、400、3000、6000 ng·mL-1的質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本。

2.4 血漿樣品的預(yù)處理

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，加入50 μL 血漿樣本，渦旋10 s，混勻，再加入200 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（30 ng·mL-1），渦旋1 min，用多管渦旋振蕩器渦旋5 min，于4 ℃、16000 r·min-1離心10 min。取上清液40 μL 加120 μL 純化水至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，渦旋混勻后，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

3 方法學(xué)確證及結(jié)果

3.1 特異性考察

精密量取伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用含0.1%氨水的乙腈溶液稀釋數(shù)倍后進(jìn)行測(cè)定，伏立康唑及其同位素內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為2.6 min，伏立康唑-N-氮氧化物及其同位素內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為1.0 min。取6 種不同來(lái)源的空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.4”項(xiàng)下處理，制備空白血漿樣本并進(jìn)行測(cè)定。本方法具有較高的選擇性，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定。見(jiàn)圖2。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本，同時(shí)制備空白血漿樣本，進(jìn)行LC-MS/MS 分析，并記錄色譜圖。分別計(jì)算伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f 對(duì)血藥濃度C 作權(quán)重回歸計(jì)算，根據(jù)最小二乘法得出直線回歸方程并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（f=a×C+b），權(quán)重系數(shù)為1/C2，計(jì)算各樣本實(shí)測(cè)濃度及準(zhǔn)確度。伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物典型標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：f=8.36×10-3C+2.79×10-2，r=0.9973；f=9.31×10-3C+3.39×10-2，r=0.9972。結(jié)果表明，伏立康唑及其代謝物伏立康唑-N-氮氧化物濃度在10.0～8000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限均為10.0 ng·mL-1。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，配制系列質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本，每個(gè)濃度配制并處理5 份樣本，共做3 批，計(jì)算批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度。該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。

3.3 介質(zhì)效應(yīng)

分別取6 種不同來(lái)源的空白血漿和純化水各50 μL，除乙腈不含內(nèi)標(biāo)外，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，取上清液作為溶劑，配制伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度為25.0 ng·mL-1和6000 ng·mL-1的介質(zhì)效應(yīng)樣本溶液和對(duì)照樣本溶液若干份。分別取上述溶液50 μL 加入濃度為3.00 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液2 μL，渦旋1 min，混勻，再取上清液40 μL 加120 μL純化水至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，渦旋混勻后，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。記錄色譜圖，計(jì)算樣本溶液、對(duì)照樣本溶液各濃度伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的平均值，各濃度樣本溶液峰面積的平均值與對(duì)照樣本溶液峰面積的平均值之比，即為相應(yīng)成分的基質(zhì)效應(yīng)。該方法待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定不受基質(zhì)干擾。見(jiàn)表2。

表2 伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物精密度、準(zhǔn)確度、介質(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果

3.4 提取回收率

本試驗(yàn)考察了伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物25.0、400、6000 ng·mL-1等3 個(gè)質(zhì)控濃度水平的提取回收率。通過(guò)比較相應(yīng)濃度質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本溶液中待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值與同一濃度介質(zhì)效應(yīng)樣本溶液中待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值，來(lái)評(píng)價(jià)回收率。該方法提取回收率良好。見(jiàn)表2。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察了伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物25.0、400、6000 ng·mL-1等3 個(gè)質(zhì)控濃度水平的血漿樣品在室溫放置20 h、-40 ℃條件下3 個(gè)凍融循環(huán)、-40 ℃條件下放置90 d 及處理后待測(cè)樣品溶液自動(dòng)進(jìn)樣器（10 ℃）放置24 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物在各處置條件下穩(wěn)定。

3.6 稀釋可靠性和殘留效應(yīng)

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項(xiàng)下方法配制含伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度均為12000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本，用空白血漿稀釋2 倍后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，重復(fù)稀釋6 次，測(cè)得濃度與加入濃度的偏差均小于±15.0%，表明該方法具有良好的稀釋可靠性。將標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本（8000 ng·mL-1）與空白血漿樣本輪流進(jìn)樣，共10 次，在待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)出峰位置無(wú)明顯干擾，表明該方法殘留效應(yīng)符合要求。

4 伏立康唑注射液藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，2 名中國(guó)健康受試者（男女各1 人）給予4 mg·kg-1的注射用伏立康唑（Pharmacia &Upjohn Company，規(guī)格200 mg）。于試驗(yàn)第1 天早上8時(shí)空腹給藥，用250 mL 的0.9%氯化鈉注射液稀釋，配制成所需的輸液濃度。血樣采集前，埋置肝素鈉抗凝留置針頭，于給藥前（-30～0 min）及靜脈滴注給藥開(kāi)始后15 min （0.25 h）、30 min （0.5 h）、45 min（0.75 h）、1、1.25、1.5、2 h （靜滴結(jié)束）、2.25、2.5、3、3.5、4、6、8、12、24、48、72 h 采集靜脈血4 mL，置于含EDTA 抗凝管中。輕搖后于4 ℃下離心，然后用吸管將血漿轉(zhuǎn)移至預(yù)先標(biāo)記好的凍存管中，每個(gè)血漿樣本分成3 份，每份600 μL 置于1.5 mL 離心管中。立即以垂直方式置于-20 ℃冰箱保存，12 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至-70 ℃±10 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。采用WinNonlin（8.0）非房室模型計(jì)算伏立康唑在人體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。2 例受試者單次靜滴注射伏立康唑后的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：AUC0-t均值為10285 ng·h·mL-1，AUC0-∞均值為12761 ng·h·mL-1，Cmax均值為1767 ng·mL-1，Tmax均值為2.0 h，t1/2均值為9.86 h；伏立康唑-N-氮氧化物的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：AUC0-t均值為24220 ng·h·mL-1，AUC0-∞均值為30850 ng·h·mL-1，Cmax均值為1631 ng·mL-1，Tmax均值為5.0 h，t1/2均值為10.6 h。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物Cmax接近，后者AUC 更大，提示代謝物同樣值得關(guān)注。

5 討論

伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物在有機(jī)溶劑中具有較高的溶解度，故可以考慮用乙腈或甲醇沉淀血漿蛋白來(lái)提取待測(cè)物。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀時(shí)在出峰位置處基線明顯抬高，而乙腈沉淀時(shí)基線波動(dòng)較小，出峰位置處無(wú)明顯的干擾峰，故采用乙腈作為沉淀劑。結(jié)果表明，用乙腈1∶4 處理可使回收率達(dá)85%以上，上清液加3 倍純化水稀釋后進(jìn)樣，未觀察到明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

伏立康唑在正離子條件下有較強(qiáng)且穩(wěn)定的質(zhì)譜響應(yīng)，故以正離子方式進(jìn)行檢測(cè)。在水相中加入0.1%的甲酸可以增加離子化效率并提高靈敏度。最低定量下限為10.0 ng·mL-1，滿足生物樣品測(cè)定過(guò)程中最低定量下限低于1/10～1/20 Cmax的要求。利用梯度洗脫優(yōu)化色譜分離條件，最初將低甲醇比（45%）維持3 min 以達(dá)到基本分離，然后在0.1 min 內(nèi)增加到95%，以沖洗內(nèi)源性成分，因有機(jī)流動(dòng)相含量高，也提高了分析物的電離效率[7]。

與高效液相色譜法相比，LC-MS/MS 具有特異性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。與以往報(bào)道的LC-MS/MS 法相比，本研究乙腈沉淀提取待測(cè)物，0.1%甲酸和甲醇為流動(dòng)相，具有更低的定量下限，操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。建立的HPLC-MS/MS 法可運(yùn)用于伏立康唑靜滴注射人體作藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)試驗(yàn)研究。