范玉琪， 王躍虹， 邵毅英， 邵小婷， 扈 敬， 徐長慶， 魏 璨

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 哈爾濱 150086)

糖尿病是世界范圍內(nèi)一種常見代謝性疾病，其特征是由于胰島素分泌障礙或胰島素抵抗而引起的血糖濃度升高[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指糖尿病患者發(fā)生的不能用冠心病、高血壓性心臟病及其他心臟病解釋的心肌病變[2]。在大多數(shù)情況下，DCM患者早期無明顯病理改變和臨床癥狀，隨后發(fā)生心肌肥厚和纖維化等，進而引起心肌收縮和舒張功能障礙，最終可導(dǎo)致充血性心力衰竭(congestive heart failure, CHF)[3]。然而其確切的發(fā)病機制尚未闡明。Khullar等人的研究表明，過度的氧化應(yīng)激被認為在DCM的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。

高爾基體(Golgi apparatus, GA)是重要的細胞器，其主要功能為將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)進行加工、分類與包裝。在氧化應(yīng)激過程中，高爾基體通過調(diào)節(jié)自身相關(guān)基因(如糖基化酶或膜轉(zhuǎn)運因子)的轉(zhuǎn)錄，影響膜 Ca2+/Mn2+ATPase的活性，改變膜表面活性成分等對自身結(jié)構(gòu)及功能做出適應(yīng)性調(diào)整，此即為高爾基體應(yīng)激(Golgi apparatus stress, GAS)[5]。Yang Z等人的研究表明，高爾基體是一種β1-腎上腺素能信號的連接體，可以決定高爾基體微環(huán)境中的局部Ca2+濃度，從而影響原代心肌細胞的蛋白質(zhì)合成和運輸[6]。Malik S 等發(fā)現(xiàn)了一種新的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)依賴性調(diào)節(jié)心肌肥厚的途徑，它依賴于高爾基體磷脂酰肌醇4-磷酸(phosphatidylinositol 4-phosphat, PI4P)在核膜上的特異性磷脂酶Cε(PLCε)水解[7]。Luisa Jungk 等[8]在慢性心房顫動患者中也發(fā)現(xiàn)了高爾基體應(yīng)激的存在。但是，在糖尿病心肌病(DCM)的發(fā)生過程中是否有高爾基體應(yīng)激的參與，目前尚未見報道。

多胺是廣泛存在于自然界中的多價陽離子烷基胺，包括精胺，精脒和腐胺。其中精胺在細胞的增殖、分化與凋亡中發(fā)揮重要作用[9]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，多胺代謝紊亂參與大鼠心肌缺血/再灌注損傷和心肌肥大的發(fā)生，給予外源性精胺可發(fā)揮心肌保護作用[10]。因此，我們推測在DCM的發(fā)生過程中有GAS的參與，外源性精胺可能通過抑制GAS在糖尿病心肌病中發(fā)揮保護作用。本文就此問題進行研究，旨在為DCM的防治提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只雄性Wistar大鼠(200～250 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，隨機分成三組(n=20)：正常對照組(Control)，糖尿病組(T1D)，精胺組(T1D+Sp)。本實驗采用60 mg/kg STZ(溶于0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)一次性腹腔注射，復(fù)制1型糖尿病模型；對照組注射相同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；精胺組連續(xù)兩周每天注射精胺(5 mg/kg/d)，然后進行STZ注射，之后每隔1 d注射精胺至12周。實驗大鼠給予STZ前禁食12 h；注射完STZ后立即喂24 h 10%蔗糖水。注射 STZ一周后，大鼠尾靜脈采血測定空腹血糖濃度(fasting blood glucose concentration, FBG)，如果FBG≥16.7 mmol/L 則確定為糖尿病大鼠造模成功。12周后，整晚禁食，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，處死各組大鼠。血樣收集到含有抗凝劑的試管中。分離心臟，一部分用2.5% 戊二醛固定，用于透射電鏡觀察。一部分儲于-80℃，用于其他實驗。

1.2 超聲檢測大鼠心肌功能

注射STZ后0周和12周，在3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉下，將Wistar大鼠剃毛，用GEVIVID 7，10S探頭，10 MHz進行彩色多普勒超聲心動圖二維成像與TDI(Tissue Doppler imaging, TDI)技術(shù)測定大鼠心臟結(jié)構(gòu)功能參數(shù)：左心室收縮期內(nèi)徑(left ventricular diameter in systole, LVIDs)和左心室舒張期內(nèi)徑(left diastolic dimension, LVIDd)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)。所有設(shè)置均經(jīng)過優(yōu)化，以獲得最大信噪比和二維圖像。

1.3 測定心肌酶cTnT、CK-MB濃度的測定

將收集到的血樣以4℃、3 000 r/min離心15 min，留取上清。利用試劑盒(南京建城生物工程研究所)測定血清中心肌肌鈣蛋白(cardiac trophonin T, cTnT)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB, CK-MB)，所有試驗均按照試劑盒說明書進行。

1.4 細胞模型建立及其分組

H9C2系大鼠心肌細胞購自上海斯信生物科技有限公司。將該細胞在含10 % 胎牛血清(FBS)、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細胞達到 70%～80% 匯合時(通常傳至6～10代)進行實驗。將H9C2細胞隨機分成3組(n=8)：正常對照組(Control)，用10%的FBS-DMEM 培養(yǎng)；高糖組(HG)，培養(yǎng)基中加入40 mmol/L葡萄糖；精胺組(HG+Sp)在10%的FBS-DMEM中加5 μmol/L的精胺預(yù)處理30 min后，換成含5 μmol/L的精胺和40 mmol/L高糖的10%的FBS-DMEM中繼續(xù)共同培養(yǎng)48 h。接種時，大皿中細胞密度為1×108個/皿，12孔板的細胞密度為1×106cells/well。

1.5 Western blot檢測蛋白的表達情況

取冷凍保存的心肌組織，液氮研磨，放入1.5 ml EP管中，加入含PMSF的RIPA裂解液裂解在冰上裂解20 min，4℃、13 500 r/min離心30 min，取上清制備組織蛋白提取液；處理48 h后各組心肌細胞，按類似方法處理同樣留取上清，用 BCA 法測定蛋白含量。用12%的SDS-PAGE 電泳分離蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量選擇配制不同濃度的分離膠，上樣，電泳，至溴酚蘭抵達凝膠底部時，停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫，5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶分別置于抗體盒中，加入相應(yīng)的一抗(GOLPH3、GM130、Cleaved Caspase3 按1∶1 000比例配制)，4℃過夜。次日用TBST洗膜，然后加入稀釋過的二抗(1∶10 000)，室溫孵育 1 h。TBST洗膜，ECL法進行顯色。應(yīng)用 Image J 圖像處理軟件對條帶進行分析，測量灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量。

1.6 免疫熒光觀察高爾基體結(jié)構(gòu)的變化

將接種在載玻片中的心肌細胞洗滌，固定并透膜。然后，將細胞用特異性一抗(GOLPH3，比例為1∶150)在4℃下免疫標(biāo)記過夜。用PBS洗滌后，將細胞與相應(yīng)熒光二抗：山羊抗兔IgG(Rockland Immunochemicals Inc, Limerick, PA)和DAPI核復(fù)染劑孵育，然后利用熒光顯微鏡(Olympus IX 51,Center Valley, PA)進行觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外源性精胺對TID大鼠心肌損傷的干預(yù)作用

與正常組相比，糖尿病組大鼠血糖明顯升高，體重顯著下降，證實糖尿病造模成功；CK-MB、cTnT明顯升高；心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯(肌絲斷裂，潤盤消失等)；射血分?jǐn)?shù)(EF)降低，左心室收縮期內(nèi)徑(LVIDs)和左心室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)顯著增加，說明糖尿病模型制備成功，大鼠出現(xiàn)糖尿病心肌病的改變外源性精胺處理可以減輕上述變化(表1，表2，圖1)

Tab. 1 Changes in blood glucose, body weight, ejection fraction and left ventricular function related parameters in each n=8)

TID: Diabetic group; TID+Sp: Spermine group; EF: Ejection fraction; LVIDs: Left ventricular internal diameter end-systolic; LVIDd: Left ventricular internal diastolic diameter

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsT1D group

GroupCK-MB(ng/ml)cTnT(pg/ml)Control19.96±0.570.84±0.13T1D28.03±1.03?2.76±0.20?T1D+Sp22.39±0.94#1.68±0.20#

CK-MB: Creatine kinase-MB; cTnT: Troponin T

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsT1D group

Fig.1Transmission electron microscopic observation of myocardial ultrastructure in each group (uncolored ×400)

A: Control; B: TID; C: TID+Sp

2.2 外源性精胺對TID大鼠心肌高爾基體應(yīng)激的干預(yù)作用

分別以cleaved Caspase3，GOLPH3和GM130與β-tubulin的比值為參數(shù)，與Control組相比：T1D組cleaved Caspase 3和GOLPH3蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，而GM130蛋白表達量顯著下降(P< 0.05)；與T1D組相比：T1D+Sp組cleaved Caspase3和GOLPH3蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，而GM130蛋白表達量顯著增加(P<0.05，圖2，表3)

GroupCleaved Caspase3GOLPH3GM130Control0.64±0.090.88±0.041.28±0.08T1D2.20±0.28?1.18±0.07?0.80±0.07?T1D+Sp0.84±0.13#0.89±0.04#1.13±0.09#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTID group

Fig.2Comparison of the expressions of golgi bodies and apoptosis-related proteins in myocardium of rats in each group (n=5)

2.3 外源性精胺對HG誘導(dǎo)的H9C2細胞高爾基體應(yīng)激的干預(yù)作用

分別以cleaved Caspase3，GOLPH3和GM130與β-actin的比值為參數(shù)，與Control組相比：HG組cleaved Caspase3和GOLPH3蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，而GM130蛋白表達量顯著下降(P< 0.05)；與HG組相比：HG+Sp組cleaved Caspase3，GOLPH 3蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，而GM130蛋白表達量顯著增加(P<0.05，圖3，表4)

GroupCleaved Caspase3GOLPH3GM130Control0.89±0.110.98±0.061.37±0.07HG1.88±0.13?1.43±0.11?0.71±0.06?HG+Sp1.19±0.07#1.08±0.06#1.24±0.09#

HG: High glucose group; HG+Sp: Spermine group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

Fig.3Comparison of expressions of Golgi apparatus and apoptosis-related proteins in H9C2 myocardial cells in each group (n=5)

2.4 外源性精胺對HG誘導(dǎo)的H9C2細胞高爾基體碎片化的干預(yù)作用

對細胞質(zhì)中的 GOLPH3 和細胞核 DAPI 進行雙染。結(jié)果表明，在正常組的H9C2 細胞中，GOLPH3 標(biāo)記的高爾基體為聚集在一起的濃密的帶狀結(jié)構(gòu)；與正常組相比，HG處理組，高爾基體的由緊湊的囊泡樣結(jié)構(gòu)向胞漿彌散；加精胺處理后，高爾基體結(jié)構(gòu)彌散程度減弱(圖4)。

Fig.4Changes of Golgi apparatus in H9C2 myocardial cells of each group (Immunofluorescence ×400)

3 討論

本文采用大劑量STZ注射成功復(fù)制了1型糖尿病(T1D)大鼠模型(血糖升高和體重減輕)，模型組大鼠出現(xiàn)心肌酶釋放增加，心肌收縮和舒張功能障礙及心肌超微結(jié)構(gòu)損傷。這些結(jié)果提示DCM大鼠模型成功建立，為后期研究奠定了基礎(chǔ)。

DCM的發(fā)生機制尚未完全闡明，一般認為與氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體障礙、炎癥和纖維化等有關(guān)，其中過度氧化應(yīng)激尤其關(guān)鍵[4]。氧化應(yīng)激是一個多細胞器協(xié)同參與的復(fù)雜生理和病理過程，高爾基體作為關(guān)鍵細胞器同樣參與其中。高爾基體除了對來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)容物進行加工(例如，蛋白質(zhì)水解、磷酸化、糖基化、磺化及脂類分類等)外，還參與離子穩(wěn)態(tài)(特別是Ca2+)和細胞凋亡等的調(diào)控，這些均與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[11]。

GOLPH3是高爾基體來源的應(yīng)激相關(guān)蛋白，位于高爾基體外膜，其表達水平與細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)[12]。同時它還是一種磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI4P)的效應(yīng)物，在維持高爾基體結(jié)構(gòu)和順行轉(zhuǎn)運方面起重要作用[13]。GM130(也被稱為GOLGA2)是一種順式高爾基體基質(zhì)蛋白, 有助于維持高爾基體的帶狀形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。GM130磷酸化后將不再與高爾基體P115結(jié)合，是高爾基復(fù)合體分裂的原因之一[14]。強烈高爾基體應(yīng)激可導(dǎo)致高爾基體的碎裂，進而引起高爾基體相關(guān)細胞凋亡[15]。

由于GM130和GOLPH3在高爾基體正常結(jié)構(gòu)功能及高爾基體應(yīng)激發(fā)揮重要作用，因此本實驗檢測了在DCM模型中這兩種蛋白的表達。

在 DCM 大鼠心肌組織和高糖損傷的 H9C2 心肌細胞中，我們發(fā)現(xiàn) GOLPH3蛋白表達顯著升高，說明損傷后高爾基體應(yīng)激的發(fā)生。而 GM130 的表達明顯降低，GOLPH3 免疫熒光染色顯示高爾基體結(jié)構(gòu)由正常的緊湊囊泡狀逐漸向胞漿彌散，都表明應(yīng)激條件下高爾基體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。眾所周知，Caspase3是細胞凋亡的共同執(zhí)行者，其增加必然引起細胞凋亡增加[16]。上述實驗結(jié)果，初步證實糖尿病心肌病(DCM)的發(fā)生有高爾基體應(yīng)激的參加，并會促進凋亡的發(fā)生。

為了防治糖尿病心肌病(DCM)，人們開展一系列研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DCM大鼠和高糖處理的心肌細胞均發(fā)生多胺代謝紊亂，內(nèi)源性精胺減少。給予外源性精胺可延緩和減輕糖尿病心肌病的進展和損傷程度，其心肌保護機制主要通過抑制p38和JNK通路，減少活性氧的產(chǎn)生[17]；增加CaSR表達，維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[18]；抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路[19]。

本文在上述研究成果的基礎(chǔ)上，進一步觀察外源性精胺能否通過抑制高爾基體應(yīng)激而發(fā)揮心肌保護作用。為此，在實驗分組時除了正常對照組和模型組外，還增加了(模型+精胺)組。本文結(jié)果顯示，外源性精胺處理可以明顯減輕DCM大鼠心臟和高糖處理的心肌細胞發(fā)生的各種病理變化。這些結(jié)果清楚地說明，外源性精胺可通過抑制高爾基體應(yīng)激并減少細胞凋亡進而發(fā)揮對糖尿病心肌病的心肌保護作用。

需要強調(diào)的是，我們的實驗結(jié)果只是初步證明高爾基體應(yīng)激參與了糖尿病心肌病(DCM)的發(fā)生發(fā)展，外源性精胺的心肌保護作用與減輕高爾基體應(yīng)激(GAS)有關(guān)。詳細具體的機制還有待今后進一步研究。