羅 強(qiáng)， 李 寧， 劉偉麗， 張 藝， 陳照立△

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院， 四川 成都 611137； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

缺氧是指機(jī)體的細(xì)胞和組織氧供應(yīng)不足，甚至出現(xiàn)用氧障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程[1,2]。氧的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)是人體能量代謝中最為重要的環(huán)節(jié)之一，當(dāng)機(jī)體氧供應(yīng)不足時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)一系列的應(yīng)激反應(yīng)，如呼吸加深加快、心跳加快、血壓升高等，需要通過調(diào)節(jié)心臟的泵血量、肺的擴(kuò)張等方式來使組織獲得足夠的氧氣[3]。當(dāng)機(jī)體處于高原低氧這種特殊地理環(huán)境下，習(xí)服不良的人群就會(huì)誘發(fā)多種急慢性高原病，其中高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)是最為常見，也是危害最大的一種慢性高原病，給高原常駐人民的工作生活帶來極大的影響[4]，主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞代償性增加，以促進(jìn)其攜氧能力的增加，幫助機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境。但紅細(xì)胞的增加會(huì)使血液粘稠度增加，血液流動(dòng)阻力增加，當(dāng)血液處于高凝狀態(tài)時(shí)會(huì)加劇各臟器缺血缺氧，從而引起耗氧量較多臟器損傷，比如腦、心、肺等，嚴(yán)重者甚至可因血管栓塞而猝死[5]。目前對(duì)于HAPC已有廣泛研究，但其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，尚不能明確，亟待深入研究。

K562細(xì)胞是從慢性粒細(xì)胞白血病患者胸水中提取并培養(yǎng)的白血病細(xì)胞，處于高度未分化狀態(tài)，屬于紅白血病細(xì)胞系，其惡性程度高，增殖快，具有可被一系列體外誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化的特點(diǎn)[6]。其具有向紅系、粒系、單核系分化的潛力[7]，能夠在低氧環(huán)境下被誘導(dǎo)分化形成紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞，是目前用于研究紅系誘導(dǎo)分化的理想細(xì)胞模型，已成為研究細(xì)胞分化的主要細(xì)胞模型[8,9]。

Atpif1是一種能與ATP合成酶結(jié)合并抑制其ATP水解活性的小蛋白，具有阻止線粒體合酶逆轉(zhuǎn)，防止細(xì)胞線粒體的耗散和缺血損傷，抑制細(xì)胞程序性死亡，維持線粒體ATP穩(wěn)定的功能[10]。相關(guān)研究表明：Atpif1對(duì)于血紅蛋白的合成也是必需的，沉默其表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致貧血的發(fā)生[11]。血紅蛋白是紅細(xì)胞中唯一的非膜蛋白，紅細(xì)胞的代償性增多是HAPC的主要特征，Atpif1調(diào)節(jié)血紅蛋白的合成，必然對(duì)HAPC的防治發(fā)揮重要作用。

因此本文以K562細(xì)胞為模型，觀察低氧作用下，K562細(xì)胞增殖、凋亡、血紅蛋白合成及Atpif1、NF-κB、Alas2的mRNA表達(dá)的變化情況，以及沉默Atpif1基因后K562細(xì)胞在低氧暴露下的血紅蛋白合成和NF-κB、Alas2的mRNA表達(dá)的變化，以此來了解Atpif1基因在血紅蛋白合成中發(fā)揮的作用，以期為HAPC的防治開辟新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

K562細(xì)胞株(人紅白血病細(xì)胞株)購(gòu)自中科院協(xié)和細(xì)胞庫。RPMI-1640 培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))、青鏈霉素混合液100×(索萊寶，北京)，胎牛血清(四季青，杭州)，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8，博士德，武漢)，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(凱基生物，南京)，RIPA細(xì)胞裂解液(索萊寶，北京)，RNA提取試劑盒(Omega，美國(guó))，SYBR Green Master ROX(Roche，美國(guó))，Lipofectamine 3000(Invitrogen，美國(guó))。氯化血紅素(生工，上海)用DMSO溶解，配置成10 mmol/L的母液，過濾分裝，置于負(fù)20℃冰箱避光保存。聯(lián)苯胺(生工，上海)用0.5%的冰乙酸將其配置成2 mg/ml的工作液，過濾分裝，置于負(fù)20℃冰箱避光保存。3111型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、3131型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(低氧)(Thermo，美國(guó))，TGL-6臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，長(zhǎng)沙)，酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)，倒置顯微鏡(Leica，德國(guó))，F(xiàn)ACSCalibar 流式細(xì)胞儀(Bio-Red，美國(guó))，ViiA7型PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))，PCR儀(Bio-Red，美國(guó))等。

1.2 K562細(xì)胞培養(yǎng)

將K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2，21%O2，74%N2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3 d換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 K562細(xì)胞相對(duì)存活率的檢測(cè)

將K562細(xì)胞分為常氧對(duì)照組和低氧實(shí)驗(yàn)組。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105cells/ml，取100l細(xì)胞懸液接種與96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，常氧對(duì)照組培養(yǎng)方法同上，低氧實(shí)驗(yàn)組在37℃，5%CO2，2%O2，93%N2飽和濕度低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入CCK-8試劑(10/孔)，待反應(yīng)2 h后采用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處的吸光度(absorbance, A)值并計(jì)算相對(duì)存活率。相對(duì)存活率(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A-空白孔A)/(對(duì)照孔A-空白孔A)]×100%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞的相對(duì)存活率為100%。

1.4 K562細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將細(xì)胞密度調(diào)至5×105cells /ml接種與6孔板，分設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)方法同上。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞，用PBS洗2次(2 000 r/min，5 min)，加入500l的Banding Buffer重懸，加入5l Annexin V-FITC和5l PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率%=早期凋亡%+晚期凋亡%。

1.5 K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白(homoglobin , HGB)含量的檢測(cè)

將細(xì)胞密度調(diào)整至5×105cells /ml接種與6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入終濃度為50mol/L的氯化血紅素溶液，培養(yǎng)方法同上。收集細(xì)胞，用PBS洗2次(2 000 r/min，5 min)，加入40l聯(lián)苯胺工作液和40l 1%H2O2，混勻，避光反應(yīng)30 min后加入10%冰乙酸0.4 ml，混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值。

1.6 K562細(xì)胞中平均血紅蛋白(mean corpuscular hemoglobin, MCH)的檢測(cè)

培養(yǎng)方法同上。收集細(xì)胞，用PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液100l，在冰上充分裂解30 min后12 000 r/min離心10 min，取上清，測(cè)定其在414 nm處的吸光度值。根據(jù)A414等于1.0時(shí)其血紅蛋白濃度為0.13 mg/ml，計(jì)算K562細(xì)胞內(nèi)平均血紅蛋白含量。

1.7 qRT-PCR對(duì)Atpif1、NF-κB和Alas2 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

培養(yǎng)方法同上，收集細(xì)胞，應(yīng)用OMEGA RNA提取試劑盒說明書提取RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，上海生工合成，PCR引物序列見表1。應(yīng)用SYBR Green 法，熒光定量PCR儀檢測(cè)Atpif1，NF-κB，Alas2 mRNA的表達(dá)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×SYBR Green Master(ROX) 10l ，PCR Forward Primer 0.5l，PCR Reverse Primer 0.5l，模板2l，滅菌水7l。反應(yīng)條件：Hold Stage：1：50℃ 2 min，2：95℃，10 min，PCR Stage：PCR 反應(yīng)Reps：40，95℃ 15 s，60℃ 30 s，Melt Curve Stage：95℃ 15 min，60℃ 30 s，95℃ 15 s。用2-ΔΔCT公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后相關(guān)基因的檢測(cè)與此方法相同。

Tab.1RT-PCR primer sequences and product sizes

GeneSequence of primers(5’-3’)Product size(bp)β-actinF 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCT-3’194R 5’-CTGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’Atpif1F 5’-GAACGATATTTCCGAGCACAG-3’209R 5’-TCTACACAGAAGTGGGCAAT-3’NF-κBF 5’-GATCCTTCTTTGACTCATAC-3’257R 5’-TTTGTGACCAACTGAACAAT-3’Alas2F 5’-TTCCATGATCCAAGGTATCCGTA-3’282R 5’-TGCATAATTCCATCACGCTC-3’

1.8 轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)HGB、MCH含量檢測(cè)

將K562細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并將其分為空白組(Blank)，陰性對(duì)照組(Negtive Control, NC)和si-Atpif1三組。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞(2 000 r/min，5 min)，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，按2×105cells/ml接種與24孔板，每孔加500l細(xì)胞懸液。其中Blank組加入50l的新鮮培養(yǎng)基，NC組和si-Atpif1組根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別加入50l的Lipofectamine 3000+si-NC的混合液和Lipofectamine 3000+si-Atpif1的混合液，并將K562細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其余方法同1.5、1.6。siRNA購(gòu)于吉瑪基因，序列見表2。

Tab. 2 The sense and antisense sequences of siRNAs

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧暴露后，K562細(xì)胞的活性受到明顯抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性逐漸降低。經(jīng)低氧暴露24 h、48 h、72 h后，其相對(duì)存活率(%)分別為84.6±3.6、59.0±3.48、47.5±5.34，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

Fig.1The relative viability of K562 cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.2 低氧對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率均有顯著上升(P<0.01)。其中培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞凋亡最為顯著(圖2，表3)。

Fig.2Effect of hypoxia on apoptosis of K562 cells

Group24 h48 h72 hControl3.97±0.255.22±0.416.88±0.37Hypoxia5.57±0.43??7.33±0.26??11.96±0.35??

**P<0.01vscontrol

2.3 低氧對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)HGB、MCH含量變化的影響

培養(yǎng)72 h后，分別與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組HGB、MCH含量顯著增加(P<0.05，表4)。

Tab. 4 The contents of HGB and MCH in K562 cells

HGB: Homoglobin; MCH: Mean corpuscular hemoglobin

*P<0.05,**P<0.01vscontrol-HGB；△△P<0.01vscontrol-MCH

2.4 低氧對(duì)K562細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組Atpif1的mRNA水平顯著增加(P<0.01)，培養(yǎng)48 h后的mRNA水平上調(diào)最為顯著；低氧實(shí)驗(yàn)組NF-κB的mRNA水平均高于對(duì)照組，整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)，且培養(yǎng)72 h后NF-κB的mRNA水平顯著高于常氧對(duì)照組(P<0.01)；低氧實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h后Alas2的mRNA水平與常氧對(duì)照組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低氧實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h后Alas2的mRNA水平明顯高于常氧對(duì)照組(P<0.05)，低氧實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)72 h后Alas2的mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.01，表5)。

Tab.5The expressions of Atpif1, NF-κB and Alas2 mRNA in hypoxia-treated K562 cells

GroupAtpif1NF-κBAlas2Control1.07±0.141.03±0.161.05±0.24Hypoxia-24 h3.64±0.21??1.18±0.02?0.98±0.10Hypoxia-48 h4.42±0.23??1.47±0.22?1.41±0.17?Hypoxia-72 h1.70±0.09??3.19±0.35??1.87±0.16??

Control: Normal oxygen control group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.5 線粒體基因Atpif1沉默對(duì)K562細(xì)胞血紅蛋白合成的影響

分別與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，si-Atpif1組的HGB、MCH含量均有降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表6)。

Tab.6The contents of HGB and MCH in K562 cells after sliencing atpif1

GroupHGBMCHBlank0.13±0.019.84±0.46Si-NC0.13±0.019.84±0.24Si-Atpif10.11±0.01??##7.70±1.12?#

Blank: Non-transfected group; Si-NC: Negative control group; Si-Atpif1: Atpif1-transfected group

*P<0.05,**P<0.01vsNC；#P<0.05,##P<0.01vsblank

2.6 線粒體基因Atpif1沉默對(duì)K562細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

分別與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，si-Atpif1組的NF-κB基因的mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，si-Atpif1組的Alas2基因的mRNA水平明顯下調(diào)(P<0.05)。其中空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Atpif1、NF-κB和Alas2基因的mRNA表達(dá)水平均沒有差異(P>0.05，表7)。

Tab.7The expressions of Atpif1, NF-κB and Alas2 mRNA after sliencing Atpif1

Group Atpif1 NF-κBAlas2Blank0.98±0.030.96±0.040.97±0.03Si-NC0.96±0.050.97±0.030.99±0.01Si-Atpif10.30±0.03??##0.65±0.02??##0.69±0.09?#

NF-κB: Nuclear factor-κB

*P<0.05,**P<0.01vsNC；#P<0.05,##P<0.01vsblank

3 討論

低氧環(huán)境會(huì)使細(xì)胞從有氧代謝轉(zhuǎn)換為無氧酵解，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)眾多參與低氧應(yīng)答的因子開始表達(dá)并調(diào)控部分細(xì)胞程序性死亡[12,13]，抑制K562細(xì)胞活性，促進(jìn)凋亡發(fā)生。同時(shí)，細(xì)胞需要改變相關(guān)基因的表達(dá)，以適應(yīng)機(jī)體發(fā)生的一系列代償反應(yīng)，其中包括血液系統(tǒng)的反應(yīng)。低氧會(huì)使紅細(xì)胞增多以增加血液對(duì)氧氣的運(yùn)輸能力，是對(duì)低氧的重要適應(yīng)代償機(jī)制[14]，血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的特殊蛋白質(zhì)，由珠蛋白和血紅素組成，血紅蛋白合成的增加可提高低氧適應(yīng)性。K562細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為紅細(xì)胞，其血紅蛋白含量的變化可以直接反應(yīng)低氧對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化影響的變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與常氧對(duì)照組相比，低氧環(huán)境可抑制細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白合成。

Atpif1是與ATP合酶相互作用的由細(xì)胞核編碼產(chǎn)生的線粒體蛋白[15]，是調(diào)節(jié)ATP合酶的內(nèi)源性小分子多肽，是調(diào)節(jié)亞鐵鰲合酶活性的重要調(diào)節(jié)因子，可有效調(diào)節(jié)血紅素和血紅蛋白的合成[11]。在低氧環(huán)境下，Atpif1上調(diào)可以抑制ATP合酶的水解活性，維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平恒定，保持細(xì)胞正常功能[16]，減少細(xì)胞損傷[17]。qRT-PCR結(jié)果表明：低氧環(huán)境可以上調(diào)Atpif1 mRNA的表達(dá)，Atpif1被激活促進(jìn)血紅蛋白合成，減少K562細(xì)胞損傷，增加其抗缺氧能力。NF-κB是一組調(diào)節(jié)廣泛基因表達(dá)的核蛋白因子，在細(xì)胞增殖、分化與凋亡[18]，免疫反應(yīng)和腫瘤形成等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，活化后能誘導(dǎo)促炎因子和抑炎因子表達(dá)。研究表明NF-κB能夠被低氧處理所激活[19]，并且參與了一系列缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控[20,21]。qRT-PCR結(jié)果表明：低氧環(huán)境可以上調(diào)NF-κB mRNA的表達(dá)，NF-κB可以被低氧環(huán)境激活，調(diào)節(jié)K562細(xì)胞的增殖和凋亡。有研究表明，NF-κB也能調(diào)控Atpif1的表達(dá)[14]。Alas2基因編碼的蛋白是血紅素合成過程中的第一個(gè)酶也是唯一的限速酶，特異存在于紅細(xì)胞系中，與血紅蛋白、肌紅蛋白等合成密切相關(guān)，是調(diào)控紅細(xì)胞分化的重要因素[22-24]。它表達(dá)的變化可以反應(yīng)血紅素的合成和紅系分化進(jìn)程的變化[25,26]，Alas2基因具有低氧反應(yīng)性，在低氧環(huán)境中Alas2 mRNA上調(diào)且細(xì)胞內(nèi)血紅素含量也增加[27]。通過qRT-PCR結(jié)果表明，低氧環(huán)境可以上調(diào)Alas2 mRNA水平，促進(jìn)K562紅系分化進(jìn)程，增加K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量，增加K562細(xì)胞的低氧適應(yīng)性。

有研究發(fā)現(xiàn)沉默Atpif1的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚貧血的發(fā)生[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默Atpif1基因可以抑制K562細(xì)胞血紅蛋白的合成，可以下調(diào)NF-κB、Alas2 mRNA的水平。NF-κB、Alas2基因與低氧暴露和血紅蛋白合成有密切聯(lián)系，血紅蛋白合成的減少和相關(guān)基因的下調(diào)說明，Atpif1參與調(diào)控血紅蛋白的合成，并且直接影響到相關(guān)基因的表達(dá)。血紅蛋白的代償性增多是HAPC的典型特征，而Atpif1可以調(diào)節(jié)血紅蛋白的合成，提示Atpif1基因可能參與了HAPC的發(fā)生。

綜上所述，低氧環(huán)境可以抑制K562細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，促進(jìn)血紅蛋白合成和Atpif1、NF-κB和Alas2基因表達(dá)的上調(diào)。沉默Atpif1基因后，抑制血紅蛋白合成且下調(diào)了NF-κB和Alas2基因的表達(dá)水平。目前普遍認(rèn)為HAPC是機(jī)體習(xí)服不良所致的紅細(xì)胞代償性增多，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未提出有效的治療方案，普遍采取間斷吸氧，或返回平原地區(qū)等方式來改善機(jī)體氧供狀態(tài)，但是不能從根本上治愈。因此，深入探究Atpif1基因在血紅蛋白合成中發(fā)揮的作用，探究其在HAPC發(fā)生中的作用，可以為防治HAPC提供新的思路和治療靶點(diǎn)。