吳 晨， 邱玉保， 孫雪倩， 陳 丹， 吳亞先， 龐慶豐

(江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122)

許多肝臟疾病，如膽結(jié)石，阻塞性黃疸，急性肝炎，原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化等都會(huì)常導(dǎo)致肝臟膽汁淤積[1]。 膽汁從肝細(xì)胞到腸道的阻塞導(dǎo)致肝臟組織中的膽汁酸積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，炎癥，細(xì)胞凋亡和纖維化，最終發(fā)展為肝硬化。然而，熊去氧膽酸(UDCA)與巴替酸(OCA)聯(lián)合用藥是迄今為止唯一批準(zhǔn)的臨床慢性膽汁淤積性肝病治療方法[2]。但OCA的價(jià)格昂貴，費(fèi)用-療效比不盡樂(lè)觀，因此，盡快開(kāi)發(fā)出大部分患者都可以承擔(dān)的膽汁淤積治療藥物極為重要。姜黃素是一種天然黃色多酚，價(jià)格適中，因其抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌性質(zhì)而被認(rèn)為是一種藥用植物[3]，一些研究報(bào)道姜黃素可以上調(diào)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)并抑制各種肝臟疾病，如急性肝損傷[4]，酒精性肝病[5]和肝纖維化[6]，但尚不清楚姜黃素是否對(duì)膽汁淤積性肝損傷有保護(hù)作用。本研究通過(guò)模擬小鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，探討姜黃素對(duì)小鼠膽管結(jié)扎所致的膽汁淤積性肝纖維化是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為肝纖維化治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及抗體

姜黃素(Cat#C1386)，鋅原卟啉IX(ZnPP，Cat#282820)，P450還原酶(Cat#C8113)，β-NADPH(Cat#N5130)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所。HO-1(Cat#ab13248)，髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)(Cat#ab9535)的一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。小鼠含生長(zhǎng)因子樣模體粘液樣激素樣受體(EMR1, 又稱F4 / 80)(Cat#MCA497GA)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)法律和機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行，并經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。BALB/c小鼠(6～8周，體重20～25 g)隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(n=6)，假手術(shù)組+姜黃素組(n=6)，BDL(n=10)，BDL +姜黃素(n=10)和BDL +姜黃素+ ZnPP(n=10)。使所有動(dòng)物適應(yīng)適當(dāng)?shù)沫h(huán)境7 d。BDL組、BDL+姜黃素組以及BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠如文獻(xiàn)所述進(jìn)行了BDL手術(shù)[7]：對(duì)小鼠進(jìn)行開(kāi)腹后，輕輕剝開(kāi)肝臟，找到與肝門(mén)靜脈伴行的一條透明膽管，用4-0手術(shù)線進(jìn)行兩次結(jié)扎，將肝臟復(fù)位后，縫合小鼠。假手術(shù)組的小鼠如造模組一樣接受剖腹手術(shù)并分離了膽管但不進(jìn)行結(jié)扎。BDL手術(shù)7 d后，假手術(shù)+姜黃素組以及BDL+姜黃素組小鼠每日進(jìn)行一次姜黃素(30 mg/kg)[8-9]腹腔注射；BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠每日腹腔注射姜黃素(30 mg/kg)以及ZnPP(50 μmol/kg)[10]一次，；假手術(shù)組和BDL組，小鼠每日腹腔注射等體積的生理鹽水一次，所有給藥過(guò)程持續(xù)7 d。BDL手術(shù)14 d后，各組小鼠摘眼球取血，收集肝臟組織，取部分肝組織用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織學(xué)檢查。另一部分立即儲(chǔ)存在-80℃，用于qRT-PCR、WB、HO-1活性檢測(cè)。

1.3 血清生化分析

BDL手術(shù)14 d后，各組小鼠摘眼球取血，在4℃冰箱中靜置過(guò)夜后，得到血清。

1.3.1 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase, AST) 檢測(cè) 采用南京建成生物研究所購(gòu)買(mǎi)的AST試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)要操作步驟如下：在測(cè)定孔與對(duì)照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及天門(mén)冬氨酸組成的基質(zhì)液及5 μl待測(cè)血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測(cè)定孔與對(duì)照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對(duì)照孔中加入5 μl待測(cè)血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測(cè)定孔和對(duì)照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)各孔OD值。絕對(duì)PD值=測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值, 查提前做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線得各組相應(yīng)AST活力單位。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase, ALT) 檢測(cè) 采用南京建成生物研究所購(gòu)買(mǎi)的AST試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)要操作步驟如下：在測(cè)定孔與對(duì)照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及丙氨酸組成的基質(zhì)液及5 μl待測(cè)血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測(cè)定孔與對(duì)照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對(duì)照孔中加入5 μl待測(cè)血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測(cè)定孔和對(duì)照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)各孔OD值。絕對(duì)PD值=測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值, 查提前做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線得各組相應(yīng)AST活力單位。

1.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察肝纖維化

將剪成合適大小的肝組織在4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋后切成4 μm切片。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色。

1.5 免疫組化檢測(cè)肝組織F4 / 80及MPO

取小鼠肝臟組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水及二甲苯透明處理后，石蠟包埋并用組織切片機(jī)進(jìn)行組織切片。將肝組織切片與HO-1(1∶200稀釋)，F(xiàn)4 / 80(1∶100稀釋)，MPO(1∶50稀釋)一抗和生物素化二抗(1∶200稀釋)孵育適當(dāng)時(shí)間，DAB顯色，在德國(guó)卡爾蔡司LAM 510光學(xué)顯微鏡下觀察所有切片，使用Image J軟件對(duì)免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 Western blot檢測(cè)肝組織HO-1蛋白表達(dá)

參照文獻(xiàn)[11]，稱取各組樣品30 mg，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上勻漿30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，然后收集上清液，BCA法定量。取20 μg蛋白樣品依次經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、HO-1一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜、二抗室溫孵育1 h、ECL顯色。GAPDH(1∶10 000)作為內(nèi)參。

1.7 肝組織HO-1活性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[12]，簡(jiǎn)要步驟如下：稱取小鼠肝臟組織約30 mg，加入預(yù)冷的400 μl含有PMSF的RIPA裂解液，將EP管插放在冰上進(jìn)行手動(dòng)勻漿，勻漿完成后以200 s一次的頻率于渦旋儀上渦旋10 s，20 min后，在提前4℃預(yù)冷好的離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min，收集含有蛋白的上清，并用BCA法測(cè)量蛋白濃度。HO-1活性檢測(cè)的反應(yīng)體系為200 μl：25 μmol/L hemin、1 mmol/L NADPH、5 mmol/L去鐵胺、0.6 U細(xì)胞色素C、80 μl小鼠肝膽綠素還原酶提取液、200 μg細(xì)胞全蛋白、剩余用PBS補(bǔ)足。

1.8 RT-PCRt檢測(cè)小鼠肝組織中HO-1 mRNA表達(dá)水平

取15 mg各組小鼠肝臟組織，使用RNA prep Pure Tissue Kit制備總RNA。通過(guò)260和280 nm處的吸光度比評(píng)估樣品的RNA產(chǎn)率和純度。使用PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 根據(jù)系統(tǒng)方案SYBR Premix Ex Taq(Takara，Japan)進(jìn)行qPCR。 本研究中的所有引物均由Sangon Biotech (中國(guó)上海)合成。定量使用GAPDH作為參照基因的2-ΔΔCt方法。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)BDL誘導(dǎo)的小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)的小鼠肝臟在14 d時(shí)表面光滑，而B(niǎo)DL小鼠顯示出結(jié)構(gòu)改變，肝臟表面出現(xiàn)水腫和纖維化結(jié)節(jié)(圖1A)。在組織學(xué)檢測(cè)中也證實(shí)由BDL手術(shù)誘導(dǎo)的肝臟特征性形態(tài)學(xué)改變，如膽管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉被分割、肝細(xì)胞腫脹形成不規(guī)則形狀且細(xì)胞核被擠壓至邊緣(圖1C)。與假手術(shù)組小鼠相比，BDL處理的小鼠肝細(xì)胞損傷標(biāo)記物ALT(P<0.01)和AST(P<0.01)顯著升高(圖1B);另外，BDL小鼠的肝臟重量與體重比與假手術(shù)組小鼠相比也出現(xiàn)升高(圖1A)。 補(bǔ)充姜黃素后，這些情況均得到改善，表明姜黃素減弱了BDL誘導(dǎo)的肝損傷。

Fig.1Curcumin attenuated BDL-induced liver injury

(A) BALB/c mice were randomly divided into sham group (n=6), sham+ curcumin group (n=6)，BDL group (n=10) and BDL+ curcumin group (n=10). After two weeks the visceral cavity was opened and the liver to body weight ratio was measured. (B) Serum levels of AST and ALT in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin group (n=10).(C) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.Values represent mean±SD.

2.2 姜黃素對(duì)BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥的影響

天狼星紅染色結(jié)果(圖2A)顯示，姜黃素+BDL組與BDL組相比，肝組織中膠原蛋白沉積減少，促肝纖維化標(biāo)志物的mRNA含量也明顯下降(圖2B，2C)，表明連續(xù)7 d以30 mg/kg劑量用姜黃素治療減少BDL導(dǎo)致的肝纖維化。同時(shí)，免疫組化染色結(jié)果(圖2D,2E)顯示，與BDL組相比，補(bǔ)充姜黃素可顯著減少巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80以及中性粒細(xì)胞標(biāo)記物MPO的表達(dá)，減輕BDL誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果表明，姜黃素對(duì)BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥具有減弱作用。

Fig.2Curcumin attenuated BDL-induced liver fibrosis and inflammation

(A) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.mRNA expression levels of collagen type I (B) and TGF-β1 (C) in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. Values represent mean±SD. The obtained liver sections were subjected to immunohistochemical examination with antibody against F4/80 (D) and MPO (E), Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of F4/80-positive cells and MPO-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed.

2.3 姜黃素對(duì)肝組織中HO-1表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組相比，BDL造模14 d后，小鼠肝組織中的HO-1蛋白表達(dá)量(圖3A,3C)及mRNA含量(圖3B)均有所上升(P<0.01),在補(bǔ)充姜黃素后，小鼠肝臟HO-1表達(dá)量進(jìn)一步顯著上升。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們猜測(cè)，姜黃素對(duì)小鼠BDL所致的肝纖維化的保護(hù)作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

Fig.3Curcumin enhanced mRNA and proteins expression levels of HO-1

(A) The obtained liver sections were subjected toimmunohistochemical examination with antibody against HO-1. Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of ho-1-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed. (B) mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. Values represent mean±SD.

2.4 HO-1抑制劑ZnPP加重BDL誘導(dǎo)的肝損傷

為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們?cè)谘a(bǔ)充姜黃素的同時(shí)連續(xù)7 d對(duì)姜黃素給藥小鼠進(jìn)行50 μmol/ kg的鋅原卟啉(ZnPP)腹腔注射。ZnPP是血紅素降解途徑中的限速酶，具有特異性抑制HO-1酶活性的能力(圖4A)，而對(duì)HO-1的mRNA水平(圖4B)或蛋白質(zhì)表達(dá)(圖4C)沒(méi)有影響。在ZnPP處理后的BDL小鼠中，仍然發(fā)現(xiàn)了實(shí)質(zhì)壞死，以及大量新形成的膽管(圖4D)和I型膠原沉積(圖4E)，提示姜黃素對(duì)BDL小鼠的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。I型膠原蛋白的mRNA水平升高(圖4F)，提示ZnPP消除了姜黃素對(duì)BDL小鼠肝纖維化的保護(hù)作用。因此我們得出結(jié)論，姜黃素對(duì)小鼠BDL所致的肝纖維化的保護(hù)作用是通過(guò)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

膽汁淤積性肝損傷是慢性肝病患者肝纖維化和肝硬化發(fā)展的主要致病因素之一，同時(shí)臨床上的治療藥物十分有限。為了評(píng)估姜黃素對(duì)膽汁淤積性肝損傷的影響，我們使用BDL作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充姜黃素可以改善BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥等肝損傷，其機(jī)制可能與HO-1調(diào)控有關(guān)。

Fig.4HO-1 inhibitor, ZnPP, aggravated BDL-induced liver damage

(A) HO-1 activity was determined in liver. (B)mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. (D) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.(E) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.(F) mRNA expression levels of collagen type I in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+ curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. Values represent mean±SD.

姜黃素是一種黃色多酚類物質(zhì)，存在于香料姜黃的根莖中，具有抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌作用。近年來(lái)，已報(bào)道了姜黃素的保肝作用。Anggakusuma[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)影響膜流動(dòng)性從而抑制病毒結(jié)合和融合，從而獨(dú)立于基因型和原代人肝細(xì)胞抑制HCV進(jìn)入，Eshaghian等[14]報(bào)道姜黃素可減輕BDL大鼠的肝纖維化和胰島素抵抗。在我們的研究中，補(bǔ)充姜黃素可降低血清中ALT和AST的水平，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積并減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果與其他研究結(jié)果一致，表明姜黃素在肝臟保護(hù)中的廣泛應(yīng)用前景。

核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合在氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[15]，可穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化平衡。蔡月琴等[16]發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝炎中，Nrf2及其下游調(diào)控因子(HO-1及NQP1等)可對(duì)抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，減緩疾病進(jìn)程。HO-1是受Nrf2調(diào)節(jié)的主要應(yīng)激反應(yīng)因子。之前的研究表明，姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2 / HO-1途徑直接激活Nrf2表達(dá)并減輕肝損傷[17-18]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，可催化游離血紅素代謝產(chǎn)生膽綠素、游離鐵離子和一氧化碳，具有突出的抗炎和抗氧化作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)提高HO-1的表達(dá)來(lái)改善實(shí)驗(yàn)性肝臟膽汁淤積，當(dāng)我們使用HO-1抑制劑ZnPP時(shí)，保護(hù)效果大大減弱。ZnPP是血紅蛋白合成時(shí)形成的一種微量正常代謝產(chǎn)物，是臨床上治療高膽紅素血癥的潛在藥物，藥效溫和，因此，我們有理由推測(cè)，ZnPP逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)于實(shí)驗(yàn)性肝臟膽汁淤積的保護(hù)作用是由于其特異性抑制了HO-1的活性，而非對(duì)機(jī)體造成了損害[19]。

綜上所述，本研究建立了模擬臨床狀態(tài)下小鼠肝纖維化模型，采用HO-1活性抑制劑ZnPP進(jìn)行干預(yù)，顯示姜黃素可通過(guò)提高HO-1表達(dá)來(lái)減輕BDL所致的小鼠膽汁淤積性肝硬化，為臨床上有效地治療肝纖維化提供新的分子靶點(diǎn)和治療策略。