伍學(xué)翠, 趙 云, 李 聰, 熊海容, 鄭智維, 周 軍, 劉 蓉, 龔 威, 劉朝奇Δ

(1. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002； 2. 宜昌市中心人民醫(yī)院， 湖北 宜昌 443003)

2018年，美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(American Heart Association，AHA)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，心血管疾病仍是全球疾病病死率的主要原因，成為人類(lèi)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。其中心肌肥厚是眾多心血管疾病的共同病理變化，是心衰、腦卒中、猝死等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。病理性心肌肥厚發(fā)生機(jī)制尚未闡明。因此，建立模擬人類(lèi)自然疾病過(guò)程的心室肌肥厚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，用于疾病發(fā)生機(jī)制及藥物干預(yù)的研究至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)心肌肥厚模型制備方法主要有壓力超負(fù)荷法、容量負(fù)荷法、激素誘導(dǎo)法等。本實(shí)驗(yàn)采用異丙腎上腺素(IsoProterenol，ISO)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌肥厚動(dòng)物模型。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是長(zhǎng)度為21-25nt的內(nèi)源性小的非編碼RNA分子，主要通過(guò)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)功能，誘導(dǎo)mRNA切割或抑制蛋白翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)[2]。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，特定的miRNA失調(diào)可能會(huì)改變心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞對(duì)病理性血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷的特異性信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致心肌肥厚和心力衰竭，miRNA在心肌肥厚的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。miRNA的特異性表達(dá)譜可作為識(shí)別疾病的生物指標(biāo)。因此，本研究探討心肌組織表達(dá)量高的miRNA在ISO誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚的表達(dá)情況，以及miRNA在心肌肥厚調(diào)控中的機(jī)制，以期為心肌肥厚疾病的防治和靶向治療提供基礎(chǔ)，有望成為一種新的治療思路[5-6]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠16只，體重280～300 g，8～9周齡，由湖北三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：(SYXK)(鄂)(2017-0061)]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循相關(guān)動(dòng)物使用和保護(hù)規(guī)定。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

ISO購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)：I5627-5G；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；RNAiso Plus和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；Step One Plus RT-qPCR儀：德國(guó)Applied Biosysterms公司；超聲儀器：Philips-EPIQ7C，探頭：L12-3。

1.3 生物信息學(xué)研究工具

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)：Targetscan(http://www.targetscan.org/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)。靶基因相關(guān)信號(hào)通路預(yù)測(cè)軟件(FunRich)。

1.4 動(dòng)物分組、模型制備

將16只大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組、模型組，每組8只，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，自由進(jìn)食水。

ISO構(gòu)建大鼠心肌肥厚模型：ISO粉劑與生理鹽水配制比為每毫升生理鹽水含0.5 mg ISO，即濃度0.5 mg/ml，模型組ISO給藥劑量1 mg/kg，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，連續(xù)10 d，對(duì)照組同樣方法給予同體積生理鹽水。

1.5 超聲檢查

給藥第10日結(jié)束后，大鼠隔夜禁食，次日稱(chēng)重，用10%水合氯醛以0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，前胸壁剃毛，充分暴露前胸壁，涂抹超聲耦合劑后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)得大鼠舒張期心室壁厚度、心腔大小及左心收縮功能。

1.6 心臟組織HE染色

心臟取材，給藥第10日結(jié)束后，大鼠隔夜禁食，次日稱(chēng)重，用10%水合氯醛以0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰臥位固定四肢，開(kāi)腹通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，取盡后打開(kāi)胸腔，取下心臟，擠去心腔內(nèi)殘余血液，稱(chēng)量并記錄，將心臟分為心尖段、中間段和心底段三部分，心尖段和心底段-80℃保存。中間段浸泡于4%多聚甲醛溶液中保存固定，24 h后換75%酒精浸泡24 h，包塊，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察左心室心肌細(xì)胞病理學(xué)改變。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)

取大鼠心臟組織用RNAiso Plus提取心臟組織總RNA，采用RT-qPCR法，用SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒，以U6 small nuclear RNA為內(nèi)參，對(duì)心肌組織miRNAs(miR199a-5P、miR206、miR133a-3P、miR499-5P)水平進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，采用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果，以倍數(shù)表示。引物序列見(jiàn)表1。

Tab. 1 Primer sequences of miR199a-5P, miR206, miR133a-3P and miR499-5P for real-time quantitative PCR

1.8 miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

運(yùn)用Targetscan、miRDB、miRwalk 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)大鼠上述4種miRNAs可能的全部靶基因，運(yùn)用FunRich軟件分析預(yù)測(cè)相關(guān)信號(hào)通路。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ISO誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚模型

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量摸索，最后確定ISO實(shí)驗(yàn)劑量為1 mg/(kg·d)，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射建立大鼠心肌肥厚模型。在造模過(guò)程中，模型組死亡1只。

2.2 心肌肥厚心臟重量、心臟重量指數(shù)及超聲參數(shù)變化

建模結(jié)束后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組心室壁(IVSd、LVPWd)增厚，心室腔變大(LV)，心功能降低(EF%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；心臟取材，稱(chēng)量大鼠心臟重量及體重，并計(jì)算心臟/體重比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠與對(duì)照組大鼠相比，模型組HW、HW/BW測(cè)量值明顯升高，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2，圖1)；提示心肌肥厚模型構(gòu)建成功。

Tab. 2 Rat heart weight, heart/body weight ratio and echocardiographic detection of ultrasound n=8)

IVSd: Interventricular septal thickness; LV: Left ventricle; LVPWd: Left ventricular posterior wall thickness; EF: Ejection fraction; HW: Heart weight; HW/BW: Heart/Body weight ratio

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig.1Rat heart ultrasound M-shaped graph

A: Control group; B: Model group

2.3 心肌肥厚的心臟組織病理學(xué)變化

經(jīng)過(guò)組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊。模型組心肌細(xì)胞體積明顯增大，心肌纖維排列紊亂，間質(zhì)增寬，符合心肌細(xì)胞肥厚的組織病理學(xué)改變(圖2)。應(yīng)用Image J分析軟件測(cè)量模型組與正常組細(xì)胞表面積，結(jié)果表明模型組細(xì)胞表面積明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig.2HE staining of rat myocardial tissues(HE ×400)

A: Control group; B: Model group

2.4 RT-qPCR檢測(cè)大鼠心肌miRNAs的表達(dá)情況

通過(guò)文獻(xiàn)檢索，選取心肌組織表達(dá)量高的miRNAs(MiR-199a-5P、-206、133a-3P、及499-5P)進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組比較，模型組中miR199a-5P、miR206表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。miR133a-3P、miR499-5P表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

GroupmiR199a-5PmiR-206miR133a-3PmiR499-5PControl1.00±0.111.00±0.091.00±0.141.00±0.11Model1.45±0.11?2.43±0.29?0.78±0.06?0.70±0.01?

*P<0.05vscontrol group

2.5 4種miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)及分析

通過(guò)Targetscan、miRDB、miRwalk 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上述4種miRNAs的全部靶基因，并運(yùn)用FunRich軟件分析預(yù)測(cè)全部靶基因相關(guān)的信號(hào)通路，并按照P值大小排序選取8個(gè)可能與心肌肥厚相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示心肌肥厚的發(fā)生可能與血管生成、自噬等相關(guān)(P<0.05，表4)。

Tab.4The main signal pathways of four miRNAs target genes involved in cardiac hypertrophy

Signal PathwayEnrichment factorPVEGF/VEGFR signaling pathway1.3703290167.41541E-15ErbB receptor signaling pathway1.3595007363.3338E-14Endothelins1.353154489.93463E-14mTOR signaling pathway1.3553754431.19308E-13Class I PI3K signaling pathway1.3553754431.19308E-13P38 MAPK signaling pathway1.6448175784.8457E-06Wnt signaling pathway1.4452891160.002828733FoxO signaling pathway1.6798045610.012412297

3 討論

ISO作為一種β受體激動(dòng)劑，可激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮主要通過(guò)增加壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，且ISO半衰期長(zhǎng)，可較好的模擬心肌肥厚發(fā)生的自然病程，已有較多研究成功的利用ISO誘導(dǎo)動(dòng)物心肌肥厚模型[7-8]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高頻超聲探頭對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行心臟檢測(cè)，可獲得清晰的二維超聲圖像，用于觀察大鼠的心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)功能，運(yùn)用M型運(yùn)動(dòng)曲線可測(cè)得大鼠心室肌厚度和心腔大小[9]。此方法為小動(dòng)物心臟肥厚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁┝艘环N簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法。

已有研究表明，心肌肥厚病變中miRNAs的表達(dá)具有重要作用[10-12]。Zhang等[13]用去氧腎上腺素體外誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞肥厚，miR-199a-5P表達(dá)增加，芪藶強(qiáng)心抑制miR-199a-5P可改善心肌細(xì)胞的肥厚效應(yīng)。Rane等[14]研究表明：miR199a-5P在心臟肥厚和通過(guò)ISO β-腎上腺素能受體刺激過(guò)程中上調(diào)，但在心肌細(xì)胞中通過(guò)AKT活化下調(diào)。這些結(jié)果提示miR199a-5P可用于抗心臟肥厚的分子靶點(diǎn)。Yang等[15]運(yùn)用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)證明，miR-206的過(guò)表達(dá)主要通過(guò)抑制腫瘤抑制蛋白FoxP1促進(jìn)心肌肥厚。這些與本實(shí)驗(yàn)研究的模型組中miR199a-5P和miR206表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致，提示這些miRNAs對(duì)于心肌肥厚的分子診斷具有重要意義。Shieh等[16]人通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-499水平升高引起細(xì)胞肥大和心臟功能障礙。吳等[17]在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，在心肌肥厚中，miR-133a表達(dá)下調(diào)，miR-133a抑制劑antagomir-133a能進(jìn)一步加強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大效應(yīng)，這些研究與本研究發(fā)現(xiàn)相符。

本文運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了4種miRNAs參與心肌肥厚相關(guān)的靶基因及其主要信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的主要信號(hào)分子基本一致。與心臟重塑及心臟肥大密切相關(guān)的miRNA異常表達(dá)主要通過(guò)參與血管生成[18-20]，自噬[21-25]，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[26]，葡萄糖代謝[27]和炎癥反應(yīng)[28]等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。而血管生成在心臟肥大的過(guò)程中起著重要作用，在體內(nèi)和體外，心肌細(xì)胞肥大生長(zhǎng)需要血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)參與，VEGF可以通過(guò)促進(jìn)微血管生成從而為心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]，且對(duì)于心肌細(xì)胞肥大的逆轉(zhuǎn)也具有重要作用[19]。通過(guò)自身磷酸化，VEGF促進(jìn)VEGF受體(VEGFRs)活化和二聚化，導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。VEGF發(fā)揮作用主要通過(guò)VEGFR1和VEGFR2介導(dǎo)。在心肌細(xì)胞中，VEGFR2參與肥大信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而VEGFR1可逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大[20]。近年來(lái)，自噬對(duì)心肌肥厚的影響得到廣泛關(guān)注。本文預(yù)測(cè)的ErbB受體信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、PI3K 信號(hào)通路、FoxO家族信號(hào)通路均參與心肌肥厚自噬相關(guān)途徑[21-24]。在對(duì)心肌肥厚作用的研究進(jìn)展中，Zou等[21]通過(guò)升主動(dòng)脈縮窄方法構(gòu)建小鼠心肌肥厚模型，檢測(cè)結(jié)果顯示自噬增強(qiáng)，通過(guò)芪藶強(qiáng)心治療后，心臟重塑和功能的改善，且可能的作用機(jī)制是對(duì)血管緊張素Ⅱ1型受體和ErbB受體激活的抑制作用。然而Li等[22]利用心臟特異性miR-199a轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示miR-199a的過(guò)表達(dá)抑制心肌細(xì)胞自噬并在體內(nèi)誘導(dǎo)心臟肥大，Yan等[23]的研究得出相似結(jié)果，當(dāng)心肌肥厚時(shí)，自噬功能受損。自噬作為一把雙刃劍[24-25]，在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中到底是通過(guò)促進(jìn)還是抑制自噬發(fā)揮作用有待進(jìn)一步深入研究。對(duì)心肌肥厚研究中涉及眾多的相關(guān)機(jī)制，都將有可能成為用于治療心肌肥厚的新靶點(diǎn)。

總之，本研究通過(guò)ISO成功構(gòu)建了心肌肥厚動(dòng)物模型，初步驗(yàn)證了心肌肥厚4種miRNAs的差異性表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了4種miRNAs相關(guān)靶基因及參與心肌肥厚的信號(hào)傳導(dǎo)通路，這些研究為心臟肥厚的調(diào)控機(jī)制及其防治措施提供了新思路。