代義闖，陳娟，談永萍，胡凱麗，唐俊妮

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

乳房炎（mastitis）是奶牛乳腺組織的炎癥，可引起組織損傷、纖維化，降低奶產(chǎn)量、奶的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，影響奶制品的加工，是造成奶業(yè)經(jīng)濟損失最為嚴(yán)重的疾病[1]。據(jù)國際奶牛聯(lián)合會統(tǒng)計，全世界每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟損失高達2000 多億元[2]；我國每年由乳房炎引起奶牛產(chǎn)奶量下降，所造成每頭奶牛損失約為1 200 元～3 600 元，每年因乳房炎造成的經(jīng)濟損失在150 億元～450 億元[3]。引起奶牛乳房炎的病原微生物達150 多種，但臨床上最常見的有20 多種，尤其葡萄球菌（Staphylococci）是最主要的感染病因之一[4-5]。葡萄球菌廣泛存在于外界環(huán)境中，擠奶員的手、擦洗乳房用的抹布和消毒不嚴(yán)的擠奶杯，是傳播該菌的主要媒介。

隨著國內(nèi)對奶牛疾病防控的重視，奶牛乳房炎防控水平提高，致病菌種類和優(yōu)勢菌發(fā)生了一定變化[6]。凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative Staphylococcus，CNS）引起的隱性乳房炎正處于上升趨勢，在國內(nèi)外均有大量的報道。楊有武[7]對青海地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CNS 菌檢出比例為43.42%。王旭榮等[8]對山西省乳房炎病原菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，分離細菌中葡萄球菌屬所占比例為7.87%，葡萄球菌中CNS 菌的檢出率為71.43%。徐佳[9]對江蘇省某奶牛場乳腺炎葡萄球菌的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CNS 菌檢出率為73.1%。郝俊璽等[10]對呼倫貝爾高寒地區(qū)奶牛乳房炎CNS 菌分離鑒定，分離率為34.5%。CNS 菌為機會致病菌，通過形成生物被膜黏附在擠奶設(shè)備、擠奶人員手部和奶牛皮膚上，進而定植在乳腺內(nèi)造成其廣泛傳播[11]。由CNS 菌引起的隱性乳房炎具有隱蔽性和持久性的特點，給防治帶來的困難更大。因此，能在早期快速地檢測凝固酶陰性葡萄球菌，對于奶牛健康狀況和奶源質(zhì)量的監(jiān)控是十分必要的。

目前，在細菌檢測技術(shù)中，大多采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，其耗時周期長、操作過程繁瑣復(fù)雜；而基于分子生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)成本高、容易出現(xiàn)假陰性和假陽性[12]。隨著分析化學(xué)技術(shù)的進步，尋找各種細菌的特征性代謝產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物譜已成為微生物快速檢測和鑒定研究的一個重要方向[13]。微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（microbial volatile organic compounds，MVOCs）是微生物代謝產(chǎn)物的重要組成部分[14-15]，也是檢測微生物的一種靈敏、特異和新型的生物標(biāo)記物[16]。Fischer-Tenhagen 等[17]利用警犬可以比較準(zhǔn)確地嗅探出金黃色葡萄球菌污染的牛乳，說明受金黃色葡萄球菌污染的牛乳具有獨特的氣味特征。Hettinga 等[18-19]分析了乳中病原菌的揮發(fā)性代謝特征，得出金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生特殊的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，能與大腸桿菌和鏈球菌的代謝輪廓進行區(qū)分。這些研究涉及葡萄球菌的菌株數(shù)量有限，鑒定出葡萄球菌揮發(fā)代謝產(chǎn)物種類偏少，不夠全面。

研究者所在課題組前期從成都市青白江區(qū)散養(yǎng)牛場采集的乳樣中分離出大量的凝固酶陰性葡萄球菌，并經(jīng)分子生物學(xué)手段鑒定出CNS 菌中許多為金黃色葡萄球菌，說明凝固酶陰性金黃色葡萄球菌在該地區(qū)廣泛流行。因此，本研究擬以5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌分離菌株為對象，在胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）和牛乳中分析不同菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型和典型代謝產(chǎn)物的峰強度變化規(guī)律，為建立基于揮發(fā)性代謝特征快速檢測牛乳中金黃色葡萄球菌的新方法提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC43300：中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心；5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌菌株編號31B、777H、0250H、S12-1 和S2-2，分離于成都市青白江區(qū)散養(yǎng)牛場的牛乳，由西南民族大學(xué)食品安全與食品微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基、Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；蒙牛純牛奶：市售；氯化鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；2×PCR Master Mix、DL 2000 DNA Marker：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L pH 8.0 乙二胺四乙酸二鈉鹽）：大連TaKaRa 公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

熱電氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography/mass spectrometer，GC/MS）[配置Triplus 自動進樣器，碳分子篩/二乙基苯/聚二甲基硅氧烷（carboxen/divinylbenzene/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭（50/30 μm）]：美國Supelco 公司；MOF-4086S 低溫冰箱、MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9203A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；DHP-9162D 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；ZWY-100H 恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-12 型電泳儀：北京市六一儀器廠；PCR 擴增儀：四川新科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離菌株的鑒定

1.3.1.1 PCR 鑒定

微波法[20]提取5 株分離菌株的基因組DNA，用葡萄球菌16S rRNA 特異性引物（Staphylococci 16S rRNA）和金黃色葡萄球菌16S rRNA 特異性引物（Staphylococcus aureus 16S rRNA）對其進行PCR 擴增，PCR 引物序列及退火溫度詳見表1。PCR 反應(yīng)體系為：2×TSINGKE Master mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，其余由去離子水補齊至20 μL。

表1 引物序列和退火溫度Table 1 Primer sequences and annealing temperatures

1.3.1.2 血漿凝固酶試驗

將保藏菌液劃線至Baird-Parker 平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。待長出典型菌落，分別挑取菌落至5 mL TSB 中，于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h。

吸取7×0.5 mL 新鮮兔血漿至小試管中，再分別加入0.3 mL TSB 培養(yǎng)物，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔0.5 h觀察一次并記錄，連續(xù)觀察6 h。如果呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，則視為陽性結(jié)果，同時以血漿凝固酶試驗陽性菌CMCC43300 和無菌生理鹽水分別作為陽性對照和陰性對照。

1.3.2 菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

1.3.2.1 細菌新鮮培養(yǎng)物制備

吸取凝固酶陰性金黃色葡萄球菌冷凍保藏菌液50 μL 接種入5 mL TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)13 h，將菌液劃線于BP 固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h。挑取具有典型特征的單菌落接入5 mL TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)13 h，作為細菌新鮮培養(yǎng)物。

1.3.2.2 樣品制備

將凝固酶陰性金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物進行梯度稀釋至10-4，吸取10-4菌懸液200 μL 分別接入350 mL TSB 和牛乳中，使初始接種量為100 cfu/mL～200 cfu/mL，于37 ℃下，200 r/min 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至12、16、20、24 h 各吸取5 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20 mL 頂空瓶內(nèi)，加入2 g 氯化鈉，加蓋密封，每個時間點取3 個平行樣品，同時取3 個空白培養(yǎng)基作為對照樣品。

1.3.2.3 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物測定

1）萃取條件

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，在80 ℃預(yù)孵化30 min，萃取10 min。

2）氣相色譜分析條件

TR-FFAP 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流模式，分流比為20 ∶1；流速1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以7 ℃/min 升溫至220 ℃并保持2 min；載氣為99.999%氦氣；進樣口溫度230 ℃；解吸時間2 min。

3）質(zhì)譜分析條件

電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度220 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍30 amu~550 amu。

1.4 數(shù)據(jù)定性與定量分析

質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)計算機自動檢索（NIST 08）進行定性分析，同時由Xcalibur 軟件系統(tǒng)完成手動對照檢索，要求正向反向匹配因子均大于750。以化合物的特征離子為依據(jù)，采用提取特征離子流模式報告揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的峰面積，作為峰信號響應(yīng)強度。每個取樣時間點的峰信號強度為3 個平行樣品的平均值扣除空白培養(yǎng)基質(zhì)的本底值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果和血漿凝固酶試驗結(jié)果

葡萄球菌16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1，金黃色葡萄球菌-16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖見圖2，血漿凝固酶試驗結(jié)果見表2。

圖1 葡萄球菌16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of Staphylococci 16S rRNA PCR amplification products

圖2 金黃色葡萄球菌-16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of S.aureus 16S rRNA PCR amplification products

表2 血漿凝固酶試驗結(jié)果Table 2 Results of coagulase test

由圖1 和圖2 可知，5 株分離菌株的基因組DNA都能擴增出葡萄球菌屬16S rRNA 特異性條帶和金黃色葡萄球菌16S rRNA 特異性條帶，表明這些菌株都為葡萄球菌，并且都為金黃色葡萄球菌。由表2 的血漿凝固酶試驗結(jié)果可得，這5 株分離菌株均為血漿凝固酶陰性菌株。

2.2 TSB 中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型和強度分析

在TSB 培養(yǎng)基中，對16 h 培養(yǎng)物檢出的物質(zhì)類型進行統(tǒng)計，5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌總計檢出33 個揮發(fā)性代謝產(chǎn)物詳見表3，包括醇類6 個、酸類2 個、醛類8 個、酮類7 個、酯類4 個、硫化物1 個、苯環(huán)類3 個、含氮化合物2 個。菌株31B 檢出醇類3 個、酸類2 個、醛類4 個、酮類4 個、酯類1 個、苯環(huán)類1 個；菌株0250H 檢出醇類4 個、酸類2 個、醛類4 個、酮類4 個、硫化物1 個、苯環(huán)類3 個；菌株777H 檢出醇類2 個、酸類2 個、醛類4 個、酮類4 個、酯類1 個、苯環(huán)類2 個、含氮化合物2 個；菌株S12-1 檢出醇類4 個、酸類2 個、醛類6 個、酮類2 個、酯類2 個、硫化物1 個、苯環(huán)類2 個；菌株S2-2 檢出醇類3 個、酸類2 個、醛類5 個、酮類3 個、酯類1 個、苯環(huán)類2 個、含氮化合物1 個。另外，菌株檢出的3-甲基-丁醛、苯甲醛、苯乙醛、丙酮、3-苯基-呋喃和2，4-雙（1，1-二甲基乙基）-苯酚的相對百分含量與TSB 空白基質(zhì)相近或低于TSB 空白基質(zhì)，說明菌株沒有產(chǎn)生這些物質(zhì)。5 株菌共同檢出了1-丁醇、乙酸、3-甲基-丁酸和2-丁酮，TSB 空白沒有這些物質(zhì)，可認為是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌在TSB 中典型的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。

表3 TSB 中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌16 h 培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型統(tǒng)計（相對百分含量）Table 3 Varieties of volatile metabolites produced from coagulase-negative Staphylococcus aureus in TSB at the 16 h（relative percentage）

續(xù)表3 TSB 中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌16 h 培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型統(tǒng)計（相對百分含量）Continue table 3 Varieties of volatile metabolites produced from coagulase-negative Staphylococcus aureus in TSB at the 16 h（relative percentage）

進一步對TSB 中凝固酶陰性金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的乙酸、1-丁醇、3-甲基-丁酸和2-丁酮響應(yīng)強度進行動態(tài)變化分析見圖3。

圖3 在TSB 培養(yǎng)過程中凝固酶陰性金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物峰響應(yīng)強度變化Fig.3 Variation of response intensities of volatile metabolites from coagulase-negative Staphylococcus aureus during cultivation process in TSB

由圖3 可知，5 株菌產(chǎn)生乙酸、1-丁醇和2-丁酮的變化規(guī)律相似，在培養(yǎng)周期內(nèi)這些峰信號強度變化幅度很小，乙酸和1-丁醇信號強度大體在0.21×106~3×106范圍內(nèi)，2-丁酮信號強度在0.1×105~3×105。5 株菌的3-甲基-丁酸信號強度呈上升趨勢，24 h 時累積強度達到最高，菌株31B、0250H、S12-1 和S2-2 的峰信號強度在1×106~1.6×106，菌株777H 的峰強度為4.56×105，不同菌株之間3-甲基-丁酸的產(chǎn)生能力存在差別。

2.3 牛乳中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型和強度分析

在牛乳中，對16 h 培養(yǎng)物檢出的物質(zhì)類型進行統(tǒng)計，結(jié)果見表4。

5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物總計檢出28 個揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，包括烷烴類1 個、醇類2 個、酸類11 個、醛類1 個、酮類9 個、苯環(huán)類2 個、含氮化合物2 個，在各類揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中酸類數(shù)量最多，其次是酮類物質(zhì)。其中菌株31B 檢出烷烴類1 個、醇類2個、酸類4 個、酮類7 個、含氮化合物1 個、苯環(huán)類1個；菌株0250H 檢出醇類1 個、酸類6 個、酮類5 個、苯環(huán)類1 個；菌株777H 檢出醇類1 個、酸類7 個、醛類1 個、含氮化合物1 個；菌株S12-1 檢出醇類2 個、酸類6 個、醛類1 個、酮類6 個、苯環(huán)類1 個；菌株S2-2 檢出醇類1 個、酸類3 個、醛類1 個、酮類7 個、含氮化合物2 個。另外，菌株檢出的癸酸、丙酮、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮的相對百分含量和牛乳空白相近，甚至低于空白基質(zhì)，說明菌株并沒有產(chǎn)生這些物質(zhì)。5 株菌共同檢出了2-呋喃甲醇、辛酸和3-甲基-丁酸，牛乳空白沒有這些物質(zhì)，被認為是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌在牛乳中典型的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。

表4 牛乳中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌16 h 培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型統(tǒng)計（相對百分含量）Table 4 Varieties of volatile metabolites produced from coagulase-negative Staphylococcus aureus in milk at 16 h（relative percentage）

進一步對牛乳中凝固酶陰性金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的2-呋喃甲醇、辛酸和3-甲基丁酸的峰響應(yīng)強度進行動態(tài)變化分析見圖4。

圖4 在牛乳培養(yǎng)過程中凝固酶陰性金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物峰響應(yīng)強度變化Fig.4 Variation of response intensities of volatile metabolites from coagulase-negative Staphylococcus aureus during cultivation process in milk

從圖4 可以看出，菌株31B 和777H 產(chǎn)生的2-呋喃甲醇強度變化規(guī)律是先升高后降低，菌株31B在16 h 時信號強度達到最高（1.95×105），菌株777H 在20 h 時信號強度達到最高（3.1×105）。菌株0250H 和S12-1 產(chǎn)生的2-呋喃甲醇強度偏低，培養(yǎng)周期內(nèi)變化幅度很小，強度范圍在0.3×104~2.5×104。菌株S2-2 產(chǎn)生的2-呋喃甲醇強度在20 h 之前基本保持不變（約1.00×104），但24 h 時快速增至8.78×105。菌株777H 產(chǎn)生的辛酸強度明顯高于其它4 株菌，菌株777H 產(chǎn)生的辛酸信號強度大于2×107，而其余4 株菌產(chǎn)生的辛酸信號強度為0.03×106~1.36×106。對于3-甲基丁酸，菌株0250H 產(chǎn)生的峰強度明顯高于其余4 株菌，從12 h 開始增加，24 h 時累積強度達到2.79×106。菌株777H 的峰信號強度在20 h 時達到最大（2.64×105），之后稍微降低。菌株31B、S12-1 和S2-2 產(chǎn)生的3-甲基-丁酸信號水平很低，僅在103~104水平。不同菌株之間代謝物產(chǎn)量有較大差異。

比較TSB 和牛乳可以看出，無論是在TSB 還是牛乳中，3-甲基-丁酸始終是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌穩(wěn)定的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。菌株31B、S12-1 和S2-2在TSB 中產(chǎn)生的3-甲基丁酸信號強度（1×106~1.6×106）遠遠高于牛乳中的強度（1×104~2×104），菌株777H在TSB 中產(chǎn)生的3-甲基丁酸信號強度稍微高于牛乳中的強度，只有菌株0250H 在TSB 和牛乳中產(chǎn)生的3-甲基丁酸信號強度相近。表明不同的培養(yǎng)基質(zhì)會影響菌株的代謝活動。

3 結(jié)論與討論

本研究針對凝固酶陰性金黃色葡萄球菌在TSB和牛乳中的代謝特征進行分析，發(fā)現(xiàn)TSB 中凝固酶陰性金黃色葡萄球菌檢出的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物以醛類、酮類和醇類物質(zhì)居多，1-丁醇、乙酸、3-甲基-丁酸和2-丁酮是5 株菌共同檢出的典型揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。牛乳中檢出的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物以酸類物質(zhì)最多且相對百分含量最高，其次是酮類物質(zhì)，辛酸、3-甲基-丁酸和2-呋喃甲醇是五株菌共同檢出的典型揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。無論是在TSB 還是牛乳中，3-甲基-丁酸始終是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌穩(wěn)定的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。不同菌株產(chǎn)生3-甲基-丁酸的強度不同，并且同一菌株在TSB 和牛乳兩種不同基質(zhì)中3-甲基-丁酸的產(chǎn)生強度也不相同。Chen 等[23]報道金黃色葡萄球菌ATCC6538在TSB 培養(yǎng)物從第10 天開始檢出3-甲基-丁酸，強度不斷增加。Tait 等[24]對在TSB 中培養(yǎng)了18 h 的金黃色葡萄球菌NCTC 6571 檢出了較高含量的3-甲基-丁酸（543 μg/mL）。Hettinga 等[18-19]分別對金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌污染的牛乳樣品進行分析，均檢出3-甲基-丁酸，并且在培養(yǎng)過程中3-甲基-丁酸的檢出強度不斷上升。本研究顯示，在培養(yǎng)過程中5 株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的3-甲基-丁酸強度呈現(xiàn)穩(wěn)定增長趨勢，產(chǎn)生情況與上述文獻報道相符。