李亞莉，董艷輝，侯麗媛，王育川，吳新明

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 五家渠 831300)

天藍(lán)冰草學(xué)名中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)，具有許多可供小麥育種利用的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，如耐寒、耐旱、抗真菌病和病毒病等[1～3]，基因組原位雜交兼具直觀、有效等優(yōu)點(diǎn)，在小麥遺傳育種研究中，該技術(shù)被廣泛用于對(duì)小麥背景下外源遺傳物質(zhì)的追蹤和鑒定[4～6]。目前，國內(nèi)外已創(chuàng)制出許多小麥-天藍(lán)冰草的中間材料, 即八倍體小冰麥、六倍體小冰麥和小冰麥異附加系[7]。我國小麥育種學(xué)家利用小冰麥異附加系進(jìn)一步創(chuàng)制和鑒定了一批有利用價(jià)值的易位系材料，且育成優(yōu)質(zhì)小麥新品種[8]。小冰麥異附加系自創(chuàng)制以來到現(xiàn)在已有二十多年，對(duì)其后代材料先后從細(xì)胞和分子水平進(jìn)行過檢測(cè)和分析，討論染色體的變異以及親本的來源[9,10]，但對(duì)于其高代材料中外源染色體的斷裂和重組過程未見相關(guān)報(bào)道，為了進(jìn)一步利用小冰麥材料改良小麥品種，本研究以小冰麥的高代材料為研究對(duì)象，即小冰麥異附加系 TAI系列，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)篩選有小片段插入、融合的后代，為創(chuàng)制異源新種質(zhì)材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料TAI系列(小冰麥異附加系)，他們的天蘭冰草染色體分別自異源八倍體小冰麥中2、中3、中4、中5所攜帶的天蘭冰草染色體組，試驗(yàn)材料由中國科學(xué)院遺傳所提供，試驗(yàn)于2017-2018年先后在中國科學(xué)院遺傳所和山西省農(nóng)科院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中期染色體的制備

根尖細(xì)胞中期染色體的制備、探針標(biāo)記方法以及原位雜交程序均按照 Han等[8]描述的方法進(jìn)行。首先，每份材料中分別選取約20粒種子，將挑選好的籽粒飽滿的種子在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待根長(zhǎng)長(zhǎng)到 2～3 cm 時(shí)，剪取生長(zhǎng)旺盛的根尖，首先根尖被果膠酶和纖維素酶的混合溶液37 ℃消化50 min，然后用70%的酒精洗2次，搗碎，離心，100% 的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位雜交技術(shù)

植物總DNA的提取采用CTAB 法[11]，利用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品 DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋至終濃度為 100 mg·L-1。

原位雜交程序按照Han等[11]描述的方法進(jìn)行，在GISH分析中，提取中間偃麥草的基因組DNA，用fluorescein-12-dUTP標(biāo)記為綠色，小麥的著絲粒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子用Texas red-5-dCTP標(biāo)記為紅色，用中國春基因組DNA作為封阻；在FISH分析中，pAs1探針的信號(hào)標(biāo)記為紅色，pSc119.2 探針的信號(hào)標(biāo)記為綠色；在Mc-GISH 分析中，染色體上綠色是中間偃麥草的信號(hào)，黃綠色是普通小麥A組的信號(hào)，藍(lán)色是B組的信號(hào)，紅色是D組的信號(hào)。細(xì)胞學(xué)鏡檢采用 OLYMPUSBX60熒光顯微鏡觀察，用Photo-metrics SenSys CCD 成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAI-I 和TAI-II系列高代材料染色體組成分析

對(duì)TAI-I 和TAI-II 系列的高代材料進(jìn)行Mc-GISH分析，發(fā)現(xiàn)在TAI-I 系列的高代材料中小麥染色體條數(shù)為42，附加2條外源染色體；TAI-II 系列的高代材料中，TAI-23材料中小麥染色體條數(shù)是40，含有4條外源染色體，其余材料中均為小麥染色體條數(shù)是42，附加2條外源染色體(表1)。

表1 TAI-I 和TAI-II 系列的高代材料染色體條數(shù)及其變異Table 1 The number of chromosomes and chromosomal changes in TAI-I and TAI-II series

材料創(chuàng)制過程中，我們將小冰麥的異附加系自交得到高代材料，始終保留能穩(wěn)定遺傳、籽粒飽滿且染色體數(shù)在42條左右的后代連續(xù)種植，收集自交后代材料。本文應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)遺傳穩(wěn)定、籽粒飽滿的高代材料進(jìn)行檢測(cè)，繼續(xù)保留小麥染色體數(shù)為42的后代。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分材料小麥染色體數(shù)穩(wěn)定在42條，并附加了2條外源染色體，只有TAI-II系列的TAI-23包含小麥染色體數(shù)為40條，附加4條外源染色體。

2.2 TAI-I系列材料中外源染色體的變異

在TAI-I系列材料中，每份選取約20粒，首先進(jìn)行GISH分析，觀察小麥染色體和外源染色體的條數(shù)，發(fā)現(xiàn)所有材料小麥染色體均為42條，另附加2條外源染色體；之后，選取染色體分布清楚的制片，應(yīng)用FISH 和 Mc-GISH技術(shù)，檢測(cè)小冰麥附加系的高代材料中小麥和偃麥草染色體在重組過程中發(fā)生的染色體變異。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAI-12、TAI-15、TAI-16三份材料中，小麥染色體和外源染色體均未發(fā)生任何改變，但是TAI-11和TAI-13兩份材料中均附加兩條B/D/Th.intermedium易位染色體，且TAI-13中2條6BS染色體丟失；TAI-17中附加2條D/Th.intermedium易位染色體，TAI-14附加兩條端著絲粒染色體，染色體很短，幾乎是其他染色體的一半，具體的染色體分布和變異如圖1所示，箭頭所指是發(fā)生變異的附加外源易位染色體。

A,B,C,D,E,F,G,H分別是TAI11-3，TAI13-1，TAI14-2，TAI17-5的體細(xì)胞染色體分布模式，箭頭指向發(fā)生斷裂和重組的染色體。圖A、C、E、G中，染色體上綠色是中間偃麥草的信號(hào)，黃綠色是普通小麥A組的信號(hào)，藍(lán)色是B組的信號(hào)，紅色是D組的信號(hào)；圖B、D、F、H中，pAs1探針的信號(hào)標(biāo)記為紅色，pSc119.2探針的信號(hào)標(biāo)記為綠色。Bar=10 μmPatterns of A and B areTAI11-3, patterns of C and D areTAI13-1, patterns of E and F are TAI14-2, patterns of G and H areTAI17-5, Arrows indicate the truncation and translocation chromosomes. In A、C、E、G, genome of Thinopyrum intermedium are labeled in green, the A genome DNA is labeled in yellow green, the D genome DNA is labeled in red, the B genome DNA is labeled in blue; In B、D、F、H, pAs1 probe is labeled in red, pSc119.2 probe is labeled in green. Bar=10 μm.圖1 TAI11-3，TAI13-1，TAI14-2，TAI17-5的根尖中期細(xì)胞染色體的GISH和FISH分析Fig.1 GISH和FISH analysis of metaphase chromosomes in root-tip of TAI11-3 and TAI13-1，TAI14-2,TAI17-5

2.3 TAI-II系列材料中外源染色體的變異

TAI-II系列材料中，每份選取約20粒，首先進(jìn)行GISH分析，觀察小麥染色體和外源染色體的條數(shù)，發(fā)現(xiàn)所有材料小麥染色體大部分為42條，附加2條外源染色體，只有TAI-23和TAI-27兩份材料不僅附加兩條易位染色體，而且小麥染色體同時(shí)發(fā)生丟失和代換；之后選取染色體分布較好的制片，應(yīng)用FISH 和 Mc-GISH技術(shù)，進(jìn)一步檢測(cè)TAI-II系列材料中所有染色體發(fā)生的變異。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAI-21、TAI-24、TAI-25、TAI-26四份材料中，小麥染色體和外源染色體均未發(fā)生任何改變，即包含42條小麥染色體且附加2條偃麥草染色體，沒有發(fā)現(xiàn)小麥和偃麥草的易位染色體。但是，TAI-22的材料中附加兩條外源染色體，在雜交過程中，小麥和外源染色體發(fā)生易位，形成D/Th.intermedium易位染色體，且易位染色體從近著絲粒處斷裂成小染色體；對(duì)小麥染色體進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，小麥的2 A染色體置換了5D染色體。TAI-23和TAI-27的材料中，小麥染色體40條，外源附加染色體4條，其中，TAI-23的材料中，小麥的6B染色體被中間偃麥草的染色體置換，小麥的3BS丟失，附加2條D/Th.intermedium易位染色體；TAI-27的材料中，2條D/Th.intermedium易位染色體從近著絲粒處斷裂成小染色體，小麥的5D染色體被2 A染色體置換。 具體的染色體分布和變異如圖2所示，箭頭所指的是附加的易位染色體。

3 討論

小麥和偃麥草的遠(yuǎn)緣雜交高代材料中，外源染色體會(huì)發(fā)生變異，形成易位染色體或者斷裂形成小染色體[12]。TAI系列是為了導(dǎo)入偃麥草的優(yōu)良抗性基因，通過遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制的育種中間材料，通常包含42條小麥染色體和2條中間偃麥草染色體[13]. 之后對(duì)這些材料進(jìn)行了更深入的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，所有材料在鑒定過程中發(fā)現(xiàn)不僅外源染色體和小麥染色體發(fā)生交換、重組，小麥染色體的不同亞組內(nèi)也發(fā)生染色體丟失、代換的現(xiàn)象。同時(shí)，由于染色體在分離、重組過程中發(fā)生錯(cuò)分裂，導(dǎo)致染色體斷裂、重組，在TAI-14、 TAI-22和 TAI-27的親本材料中，均發(fā)現(xiàn)了端粒染色體和小染色體[14,15]。

本研究應(yīng)用GISH, FISH 和 Mc-GISH 技術(shù), 繼續(xù)篩選TAI系列的后代材料，發(fā)現(xiàn)TAI-12、TAI-15、TAI-16、TAI-21、TAI-24、TAI-25、TAI-26附加的2條中間偃麥草染色體仍然沒有發(fā)生斷裂、重組等變異，其它材料中外源染色體和小麥染色體發(fā)生交換、重組，新形成的易位染色體又發(fā)生整臂斷裂等現(xiàn)象，這些染色體變異主要是由于減數(shù)分裂期間，中間偃麥草染色體發(fā)生錯(cuò)分裂產(chǎn)生小染色體，或者產(chǎn)生的端著絲粒染色體和小麥染色體發(fā)生融合，形成易位染色體[16,17]，而新形成的易位染色體不穩(wěn)定，TAI-22材料在著絲粒區(qū)域發(fā)生斷裂整臂丟失(圖2 M)。對(duì)比所有TAI系列材料的染色體組成發(fā)現(xiàn)，有些材料后代比較穩(wěn)定，雖附加2條外源染色體，但是小麥和偃麥草染色體均能正確分離和配對(duì)，后代比較穩(wěn)定，但是，有些材料隨著繁育代數(shù)的增加，外源染色體會(huì)發(fā)生斷裂，然后和小麥染色體重組，形成易位染色體。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究對(duì)TAI 系列的材料進(jìn)行了更深入的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)更多的染色體變異情況，包括小麥A、B、D之間的代換和丟失；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同材料隨著代數(shù)的增加，染色體組成也會(huì)發(fā)生不同程度的變異，下一步將繼續(xù)鑒定附加染色體的亞型，并考察育成小冰麥TAI材料的農(nóng)藝性狀，為改良小麥品種篩選優(yōu)良的育種中間材料。