張偉云， 王 玉， 王旭東， 王志兵*

(1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130012;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130021)

0 引 言

蛹蟲草為子囊菌門，肉座目，麥角菌科，蟲草屬的模式種，又名北蛹蟲草。蛹蟲草分布廣闊，在四川、遼寧、貴州、廣東、吉林、河北、陜西、湖北、云南、廣西、福建、安徽等地均有生長(zhǎng)。蛹蟲草功效同冬蟲夏草的功效近似。并且藥化、藥理試驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)證明，蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的代用品[1]。其功效成分主要包括氨基酸及蛋白質(zhì)類、糖類、核苷酸類、蟲草酸、生物堿類、SOD等化學(xué)物質(zhì)[2]。蛹蟲草具有抗菌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等重要作用[3]。研究表明，蛹蟲草對(duì)于荷瘤小鼠或荷肝癌小鼠的免疫功能有顯著增強(qiáng)作用[4-5]。蛹蟲草對(duì)免疫低下模型小鼠有增強(qiáng)免疫力作用[6-8],可以恢復(fù)因運(yùn)動(dòng)引起的T淋巴細(xì)胞免疫抑制[9]。蛹蟲草對(duì)輻射小鼠的免疫損傷有保護(hù)作用[10]。綜上可知，蛹蟲草在免疫抑制、損傷方面的研究較多，對(duì)正常機(jī)體免疫能力的影響研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)正常小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、小鼠碳廓清試驗(yàn)，觀察蛹蟲草在細(xì)胞免疫功能和巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。旨在分析蛹蟲草對(duì)正常機(jī)體內(nèi)免疫能力的影響，并為其功能物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究以及醫(yī)藥和保健食品方面研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣品

蛹蟲草粉，由鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司提供。人體每60 kg推薦劑量1.0 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性KM小鼠，體重18～20 g，SPF級(jí)，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物室環(huán)境條件：溫度19～23 ℃，相對(duì)濕度40%～65%。

1.3 劑量分組

按人體推薦量 5、10、20 倍的劑量設(shè)計(jì)，最終設(shè)三個(gè)劑量組，分別為83.3、166.7、333.3 mg/(kg·BW)，配制方法：稱取受試物8.33、16.67、33.33 g，分別用蒸餾水定容至 2 000 mL，混勻，低溫保存，蒸餾水為對(duì)照組。每天按20 mL/(kg·BW)灌胃給藥。依據(jù)不同試驗(yàn)將小鼠分四組,每組包括對(duì)照組及供試品低、中、高劑量組。

1)實(shí)驗(yàn)一組：ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；

2)實(shí)驗(yàn)二組：遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；

3)實(shí)驗(yàn)三組：淋巴器官/體重比值測(cè)定和碳廓清實(shí)驗(yàn)；

4)實(shí)驗(yàn)四組：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

小鼠連續(xù)灌胃30 d，之后開(kāi)展試驗(yàn)。

1.4 主要儀器和試劑

細(xì)胞離心管、96孔微量血凝實(shí)驗(yàn)板、T1000型電子天平、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、SG-603生物安全柜、550型酶標(biāo)儀、LD5-2A離心機(jī)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、打孔器、二氧化碳培養(yǎng)箱、JJ-100電子天平、顯微鏡、JA2003型電子天平。

2,4二硝基氟苯DNFB、2%綿羊紅細(xì)胞SRBC、小牛血清、印度墨汁、RPMI1640培養(yǎng)液、刀豆蛋白ConA、MTT、異丙醇、硫化鋇。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法[11-13]

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版):

1)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。無(wú)菌取脾，置于盛有無(wú)菌Hank’s液平皿中，將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。將每一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔作為對(duì)照，置 5%CO2，37 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5 mg/mL)50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔作3個(gè)平行孔(100 μL/孔)，在570 nm波長(zhǎng)采用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。

2)二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)。小鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3 cm×3 cm，之后采用1%DNFB(試驗(yàn)前稱取DNFB 50 mg，置清潔干燥帶蓋小瓶中，加入丙酮油溶液[丙酮∶麻油=1∶1]5 mL)50 μL均勻涂抹致敏小鼠后,第5天再用DNFB涂抹右耳兩面進(jìn)行攻擊 ,24 h后處死動(dòng)物，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重，以左右耳的重量之差來(lái)表示DTH的程度。

3)小鼠碳廓清試驗(yàn)。按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(取印度墨水原液12 mL+生理鹽水48 mL共稀釋液60 mL，反復(fù)震蕩混勻)，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液(稱取Na2CO30.2 g，加蒸餾水至200 mL。溶液分裝到82支小試管中，每只2 mL)中。各吸0.1 mL于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死,取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。

4)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。半體內(nèi)法:制備20%的雞紅細(xì)胞懸液；每只鼠腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液1 mL,間隔30 min，脫臼處死動(dòng)物,將其仰位固定于鼠板上,正中剪開(kāi)腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。之后打開(kāi)腹腔并吸出腹腔洗液1 mL,平均分滴于2片載玻片上,將加入腹腔液的載玻片小心放入墊有濕紗布的盒內(nèi)，37 ℃溫育30 min；孵育結(jié)束用生理鹽水漂洗, 晾干,以1∶1的丙酮甲醇溶液固定5 min,再用4%Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min, 蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞,計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

通常采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)方差不齊或非正態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，滿足正態(tài)或方差齊后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未滿足正態(tài)或方差齊，則采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般毒性觀察

在30 d灌胃過(guò)程中，小鼠呼吸平穩(wěn)、皮毛光滑、活動(dòng)正常、口鼻處無(wú)明顯可見(jiàn)分泌物，實(shí)驗(yàn)中小鼠無(wú)死亡。蛹蟲草對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響，各劑量組與對(duì)照組比較P>0.05，表明蛹蟲草灌胃后小鼠發(fā)育正常，未見(jiàn)明顯與受試物相關(guān)的毒性反應(yīng)，見(jiàn)表1～表4。

表1 實(shí)驗(yàn)一組試驗(yàn)前后小鼠體重變化

表2 實(shí)驗(yàn)二組試驗(yàn)前后小鼠體重變化

表3 實(shí)驗(yàn)三組試驗(yàn)前后小鼠體重變化

表4 實(shí)驗(yàn)四組試驗(yàn)前后小鼠體重變化

2.2 蛹蟲草對(duì)動(dòng)物淋巴器官/體重比值的影響

蛹蟲草對(duì)小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無(wú)明顯影響，各劑量組與對(duì)照組比較均為P>0.05。蛹蟲草對(duì)動(dòng)物淋巴器官/體重比值的影響見(jiàn)表5。

表5 蛹蟲草對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值的影響

2.3 蛹蟲草脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果

蛹蟲草中、高劑量組可以顯著性增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，與對(duì)照組比較P<0.05，見(jiàn)表6。

表6 蛹蟲草對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

2.4 蛹蟲草對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

蛹蟲草中、高劑量組可以顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，與對(duì)照組比較P<0.05，見(jiàn)表7。

表7 蛹蟲草對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

2.5 蛹蟲草碳廓清試驗(yàn)結(jié)果

蛹蟲草各劑量組均能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)，與對(duì)照組比較P<0.05，見(jiàn)表8。

表8 蛹蟲草對(duì)小鼠碳廓清功能的影響

2.6 蛹蟲草腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

蛹蟲草中、高劑量組能顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬率，與對(duì)照組比較P<0.05，見(jiàn)表9。

表9 蛹蟲草對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

3 討 論

冬蟲夏草是名貴的傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)肺、腎,益精填髓功效。大量研究表明,蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品[14]。

我們對(duì)鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司提供的蛹蟲草進(jìn)行細(xì)胞免疫功能和巨噬細(xì)胞吞噬功能方面的研究，細(xì)胞免疫是免疫系統(tǒng)的重要組成之一，可以通過(guò)控制自身抗體的產(chǎn)生，達(dá)到修復(fù)免疫損傷以及自身免疫調(diào)節(jié)的作用。從實(shí)驗(yàn)中可以看出,中、高劑量組能顯著性增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力(P<0.05),顯著性增強(qiáng)二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(P<0.05)，說(shuō)明蛹蟲草可以明顯增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫能力。

巨噬細(xì)胞作為參與機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞，具有極強(qiáng)吞噬功能。不僅可以發(fā)揮免疫防御作用，也可以在免疫應(yīng)答中實(shí)施免疫調(diào)節(jié)作用，因此巨噬細(xì)胞吞噬能力是機(jī)體免疫強(qiáng)度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)在巨噬細(xì)胞吞噬功能方面選擇腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)和小鼠碳廓清試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)蛹蟲草各劑量組均能顯著性增強(qiáng)小鼠碳廓清能力(P<0.05)；中、高劑量組可以顯著性增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能(P<0.05)。說(shuō)明蛹蟲草可以顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能。

蛹蟲草作為傳統(tǒng)中藥具有悠久的食用歷史，其食用價(jià)值和藥理作用受到越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)可，其中免疫調(diào)節(jié)方面也有較多研究，但筆者發(fā)現(xiàn)蛹蟲草的免疫研究主要集中在免疫抑制、損傷方面，對(duì)正常機(jī)體免疫能力的影響研究較少。本研究結(jié)果旨在分析蛹蟲草對(duì)正常機(jī)體內(nèi)免疫能力的影響,并為其功能物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究以及醫(yī)藥和保健食品方面研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。