陳啟銘， 代杰文， 卞 遷

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院，口腔顱頜面科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所；2. 上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，上海 200011）

作為SOX 家族的成員，轉(zhuǎn)錄因子SOX9 通過(guò)激活細(xì)胞干性基因、調(diào)控細(xì)胞分化、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方式，在軟骨、性腺等組織器官發(fā)育過(guò)程中起到了重要的作用，并且還同結(jié)、直腸癌等腫瘤的預(yù)后相關(guān)[1-2]。既往研究揭示，SOX9 單倍劑量不足是彎肢發(fā)育異常（campomelic dysplasia, CMPD）的致病因素[3]。該病是一種半致死性的軟骨及骨發(fā)育障礙，其特征性表現(xiàn)包括脛骨彎曲、小下頜及氣道狹窄等，同時(shí)亦可伴有性別反轉(zhuǎn)。 SOX9 基因不同區(qū)段內(nèi)非編碼序列的轉(zhuǎn)位、 微缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常還可分別導(dǎo)致Pierre Robin 序列征(Pierre Robin sequence, PRS)、單純性別反轉(zhuǎn)(disorders of sex development, DSD)等疾病的發(fā)生[4]。 因此，本文就已知的SOX9 基因相關(guān)增強(qiáng)子進(jìn)行系統(tǒng)性論述， 聚焦不同增強(qiáng)子調(diào)控SOX9時(shí)空表達(dá)模式及機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 SOX9 基因三維結(jié)構(gòu)、染色體結(jié)構(gòu)異常及相關(guān)疾病

SOX9 基因位于人基因組17q24.3 上，其非編碼序列的染色體結(jié)構(gòu)異常，如微缺失、轉(zhuǎn)位等已被證明與多種疾病相關(guān)。 根據(jù)對(duì)應(yīng)的不同表型， 可將SOX9 上游的基因非編碼區(qū)劃分為不同的區(qū)間：彎肢發(fā)育異常相關(guān)區(qū)域（50～375 kb），無(wú)彎肢軟骨發(fā)育異常相關(guān)區(qū)域 （789～932 kb）， 性別反轉(zhuǎn)相關(guān)區(qū)域（516～640 kb）及 Pierre Robin 序列征相關(guān)區(qū)域（1.06～1.23 Mb）[5-8]等。 這些疾病表型同 SOX9 在軟骨、性腺發(fā)育中的核心調(diào)控地位相一致，且呈現(xiàn)出染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生的位置距離SOX9 越遠(yuǎn)， 疾病表型越輕的趨勢(shì)。 染色體結(jié)構(gòu)異常影響SOX9 的表達(dá)可能是通過(guò)改變?nèi)S基因組結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的[9]。 拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（topologically associating domain, TAD） 作為染色體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)性單位，包含一個(gè)或多個(gè)基因及其調(diào)控元件， 并通過(guò)富含CTCF 結(jié)合位點(diǎn)的邊界(TAD boundary)彼此分隔，形成了基因調(diào)控的獨(dú)立區(qū)域。小鼠SOX9 基因坐落于單獨(dú)的TAD 內(nèi)(SOX9 TAD)，與其相鄰的TAD 包含Kcnj2 和Kcnj16 兩個(gè)鉀離子通道相關(guān)基因(Kcnj TAD)[10]。 近期研究表明，當(dāng)構(gòu)建SOX9 TAD 內(nèi)的倒位時(shí)， 可在小鼠模型上觀察到骨及軟骨發(fā)育異常、腭裂、指端發(fā)育不良的表型[11]。 值得注意的是，TAD 作為染色體三維結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)性單元，雖然可通過(guò)縮短增強(qiáng)子及啟動(dòng)子間的距離促進(jìn)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作，但該互相作用還受到增強(qiáng)子性質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等因素的影響[12]。 因此，發(fā)掘調(diào)控SOX9 在不同組織中表達(dá)的增強(qiáng)子對(duì)于理解SOX9 的基因表達(dá)調(diào)控具有基礎(chǔ)性意義。

2 SOX9 軟骨特異性增強(qiáng)子

SOX9 對(duì)于軟骨發(fā)育的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用貫穿于除肥大軟骨細(xì)胞以外的諸多階段[13]。 既往研究明確揭示了SOX9 與軟骨相關(guān)的組織特異性增強(qiáng)子。如Yao 等[14]通過(guò)LacZ 報(bào)告小鼠顯示E84 增強(qiáng)子在前肥大軟骨細(xì)胞區(qū)域，如肋軟骨中份、脛骨近端及腰椎等有顯著的活性， 而E195 增強(qiáng)子報(bào)告小鼠則在軟骨組織柱層及增殖層顯色明顯。 不同于以上2 種增強(qiáng)子報(bào)告小鼠的表達(dá)模式， 位于SOX9 上游250 kb 的增強(qiáng)子 E250 能夠指導(dǎo) LacZ 在前軟骨細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)模式同E84 呈現(xiàn)互補(bǔ)。 以上研究結(jié)果表明，SOX9 上游含有調(diào)控其在軟骨發(fā)育不同階段的增強(qiáng)子， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)SOX9 時(shí)空表達(dá)水平的調(diào)控。

SOX9 軟骨相關(guān)增強(qiáng)子除了能調(diào)控其在軟骨發(fā)育不同階段的表達(dá)以外，亦對(duì)其在不同解剖部位的表達(dá)具有調(diào)控作用。 Mochizuki 等[15]發(fā)現(xiàn)在SOX9 上游約1 Mb 的區(qū)域內(nèi)包含一個(gè)增強(qiáng)子元件， 該增強(qiáng)子指導(dǎo)LacZ 在肋骨、胸骨等胸腔軟骨中特異性表達(dá)，因此被命名為RCSE 增強(qiáng)子（Rib cage-specific enhancer）。 敲除該增強(qiáng)子后可出現(xiàn)胸廓容積縮小、胸椎彎曲、肋骨短小等表型，組織學(xué)上表現(xiàn)為肥大軟骨細(xì)胞層增寬，而增殖層縮短，提示RCSE 增強(qiáng)子特異性地調(diào)控SOX9 在胸腔軟骨組織中的表達(dá)。

3 SOX9 顱頜面特異性增強(qiáng)子

除了在四肢及軀干的骨和軟骨發(fā)育中發(fā)揮核心調(diào)控作用以外，SOX9 在顱頜面組織，特別是顱頜面骨組織的發(fā)生中亦起到了關(guān)鍵的作用。 與四肢及軀干骨不同的是，頜面部骨組織起源于顱神經(jīng)嵴細(xì)胞(cranial neural crest cells, CNCCs), 且不同的顱頜面諸骨分別通過(guò)膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種不同方式形成[16]。 既往研究通過(guò)在小鼠體內(nèi)模型上特異性敲除SOX9 在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)錘骨、砧骨、Meckel 軟骨等缺如，且下頜短小，提示軟骨內(nèi)成骨障礙[17]。 這一研究為后續(xù)闡明SOX9 在顱頜面發(fā)育中的調(diào)控作用，特別是對(duì)下頜骨等與軟骨內(nèi)成骨相關(guān)組織的發(fā)育調(diào)控作用提供了充分的基礎(chǔ)。

目前已經(jīng)闡明的SOX9 顱頜面特異性增強(qiáng)子包括 9CE4Z、F2、E3 等。Benko 等[18]在 2009 年發(fā)表的文章中研究了在SOX9 基因非編碼區(qū)中可能蘊(yùn)含的調(diào)控SOX9 于顱頜面組織中表達(dá)的元件，并在T3 轉(zhuǎn)位區(qū)域上游以及F1 微缺失區(qū)段內(nèi)， 分別鑒定出9CE4Z 和F2 兩個(gè)順式作用元件，進(jìn)而在E9.5 小鼠胚胎中利用LacZ 驗(yàn)證其于下頜間充質(zhì)的表達(dá)。 體外EMSA、ChIP 結(jié)果表明內(nèi)源性Msx1 可結(jié)合到F2增強(qiáng)子上，而當(dāng)其序列發(fā)生T＞C 點(diǎn)突變時(shí)，則影響Msx1 同增強(qiáng)子的結(jié)合能力。 Msx1 是調(diào)控顱頜面骨組織發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其突變被報(bào)道同面裂相關(guān)[19-20]。 值得一提的是，后續(xù)研究表明F2 家系中T＞C 的點(diǎn)突變遺傳來(lái)自無(wú)PRS 表型的第1 代，而該家系中具有PRS 表型的患者除F2 點(diǎn)突變以外，同時(shí)亦含有FOXC2 基因的移碼突變[21]，提示F2增強(qiáng)子突變?cè)赑RS 發(fā)生機(jī)制中可能并非起到核心作用，SOX9 相關(guān)顱頜面表型可能與更多未知的增強(qiáng)子突變相關(guān)。

此外，通過(guò)比較人、小鼠等物種SOX9 區(qū)域基因序列的相似性，Bagheri-Fam 等[22]鑒定了若干SOX9顱頜面潛在增強(qiáng)子， 并在小鼠上通過(guò)LacZ 驗(yàn)證其組織特異性。 如SOX9 上游251 kb 的E3 增強(qiáng)子可介導(dǎo)LacZ 在E9.5 顱神經(jīng)嵴細(xì)胞及內(nèi)耳區(qū)域特異性表達(dá)，而SOX9 下游95 kb 的E7 增強(qiáng)子則調(diào)控報(bào)告基因在早期的端腦及中腦的表達(dá)。 另外，Gordon等[21]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了在E11.5 顱頜面組織中，SOX9 位點(diǎn)附近的若干潛在增強(qiáng)子，并在小鼠及斑馬魚(yú)模型中予以驗(yàn)證。 其中，mm 628、mm 634、mm 635 及mm 636 等增強(qiáng)子具有下頜、下唇、側(cè)鼻突等組織特異性表達(dá)模式。

4 SOX9 性腺特異性增強(qiáng)子

在哺乳動(dòng)物性別決定過(guò)程中，首先形成具有睪丸及卵巢雙向分化潛能的性腺組織， 其中向睪丸方向分化由SRY 基因決定。 SRY 通過(guò)上調(diào)SOX9的表達(dá)以啟動(dòng)雄性性腺的發(fā)育[23-24]。 在小鼠睪丸組織中，SRY 協(xié)同 SF1 結(jié)合并激活 SOX9 上游 TES 增強(qiáng)子（Testic specific enhancer）以啟動(dòng)其表達(dá)[25-26]。 近期研究利用ATAC-seq 等技術(shù)鑒定了位于SOX9 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游565 kb 的Enh13 增強(qiáng)子。Enh13 增強(qiáng)子序列包含SRY 及SOX9 結(jié)合位點(diǎn)，敲除Enh13后可導(dǎo)致SOX9 mRNA 水平降低， 并可觀察到XY性別反轉(zhuǎn)的表型，驗(yàn)證了該增強(qiáng)子在小鼠睪丸發(fā)育中決定SOX9 表達(dá)的核心作用[27]。

除小鼠以外， 調(diào)控SOX9 在人性別決定的相關(guān)增強(qiáng)子也得到了闡明。 利用生物信息學(xué)方法，Croft等[28]對(duì)人基因組SOX9 上游調(diào)控序列進(jìn)行了分析，篩選出3 個(gè)調(diào)控性腺發(fā)育的SOX9 增強(qiáng)子：eSR-A、eSR-B 及eALDI。這3 個(gè)增強(qiáng)子具有協(xié)同作用，能共同調(diào)控SOX9 在睪丸組織中的表達(dá)。 Croft 等認(rèn)為在雄性性別發(fā)育過(guò)程中的前驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子， 如SRY 和SF1，首先結(jié)合于eALDI 增強(qiáng)子上，啟動(dòng)SOX9 轉(zhuǎn)錄表達(dá)， 進(jìn)而 eSR-A、eSR-B 及 eALDI 三者通過(guò)與SOX9 啟動(dòng)子區(qū)域形成染色質(zhì)環(huán)，共同上調(diào)SOX9 表達(dá)水平。

綜上所述，隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控和疾病研究的逐漸深入，越來(lái)越多的遺傳性疾病被證明同基因的非編碼區(qū)相關(guān)。 其中，增強(qiáng)子作為基因非編碼區(qū)調(diào)控元件的代表， 可通過(guò)在空間上向啟動(dòng)子靠近，或通過(guò)轉(zhuǎn)錄非編碼RNA 穩(wěn)定染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)， 發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)控作用， 是近年來(lái)的一大研究熱點(diǎn)。SOX9 作為在軟骨、性腺發(fā)育中的核心基因，其上下游非編碼區(qū)域的異常可導(dǎo)致軟骨發(fā)育不良、性別反轉(zhuǎn)等表型，為研究基因非編碼區(qū)異常的致病機(jī)制提供了良好的模型。 盡管SOX9 在軟骨及性腺等組織表達(dá)的增強(qiáng)子已得到了初步發(fā)掘，但更為全面的增強(qiáng)子調(diào)控圖譜還有待進(jìn)一步揭示。 此外，這些不同增強(qiáng)子實(shí)現(xiàn)組織特異性調(diào)控SOX9 表達(dá)的機(jī)制還需深入研究。 隨著全基因組測(cè)序技術(shù)和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)等的發(fā)展， 為鑒定更多SOX9 增強(qiáng)子提供了可能。另外，VISTA Enhancer Browser、ENdb database等增強(qiáng)子數(shù)據(jù)庫(kù)的開(kāi)發(fā)，為增強(qiáng)子的功能注釋提供了可靠的信息來(lái)源[29-30]。