楊丹　杜鳳鳳　常雅軍　崔鍵　孫林鶴　劉曉靜　姚東瑞

摘 ?要：以129份株型多樣性豐富的蓮屬（Nelumbo Adans.）群體為供試群體，觀測與株型相關(guān)的立葉高度、花柄高度、立葉短徑、立葉長徑等數(shù)量性狀。供試荷花群體株型性狀變異豐富，立葉高度、花柄高度變異系數(shù)分別達(dá)39.68%和41.69%，立葉短徑、立葉長徑變異系數(shù)分別為29.70%和31.41%。選用多態(tài)性好的98對SSR引物對129份蓮屬種質(zhì)進(jìn)行多位點(diǎn)掃描。利用STRUCTURE V2.2軟件對供試蓮屬品種進(jìn)行基于混合模型的群體結(jié)構(gòu)分析。利用GLM模型分析與蓮株型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。結(jié)果表明：從群體結(jié)構(gòu)看，供試群體最終可被劃分為4個(gè)亞群，中國蓮傳統(tǒng)品種和中美雜交種屬于不同的亞群，同時(shí)有部分遺傳背景復(fù)雜的雜交種在不同亞群間分布。通過關(guān)聯(lián)分析共找到11個(gè)標(biāo)記與花柄高度、立葉高度、立葉長徑、立葉短徑等4個(gè)性狀顯著相關(guān)。其中，SSR067、SSR132、SSR458標(biāo)記與所觀測株型性狀均顯著相關(guān)，可能由于基因連鎖或者一因多效引起。在連續(xù)2年的重復(fù)試驗(yàn)中，SSR132和SSR458標(biāo)記均可與立葉長徑、立葉短徑相關(guān)聯(lián)，表明這2個(gè)標(biāo)記可能受環(huán)境影響較小。

關(guān)鍵詞：荷花;株型;群體結(jié)構(gòu);關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S813.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Association Studies of Plant Architecture Traits and SSR Markers in Nelumbo Adans.

YANG Dan， DU Fengfeng， CHANG Yajun， CUI Jian， SUN Linhe， LIU Xiaojing*， YAO Dongrui*

Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014， China

Abstract： Totally 129 lotus accessions with different architecture were used as the experimental material. The leaf height， flower height and leaf diameter were determined. The accessed lotus population had diverse plant architecture traits. Variation coefficient for leaf height and flower height was 39.68% and 41.69% respectively， and variation coefficient for leaf length and width was 29.70% and 31.41% respectively. 129 lotus accessions were genotyped with 98 pair polymorphic SSR primers. Population structure of lotus accessions was analyzed using the STRUCTURE V2.2 software. Association analysis of lotus architecture traits was performed with the GLM model. The results indicated that lotus accessions were divided into four subgroups. The results distinctly grouped lotus accessions from Chinese lotus and Sino-American hybrids into different clusters. However， the hybrids dispersed among clusters. The results showed that 11 SSR markers were associated with leaf height， flower height， leaf length and width; three markers were associated with all the plant architecture traits， and that might be caused by multiple effects of one gene or genetic linkage. In two years of repeated tests， two markers （SSR132 and SSR458） can be associated with leaf length and width， indicating that these two markers may be less affected by environment.

Keywords： Nelumbo; plant architecture; population structure; association analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.002

荷花是蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo）多年生水生植物，是被子植物中起源最早的物種之一，在中國已有2500多年的栽培歷史[1]。荷花作為我國十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值，同時(shí)兼具食用、藥用價(jià)值，是我國最具特色、栽培面積最大的水生經(jīng)濟(jì)植物。蓮品種繁多，目前已超過800余種[2]。

蓮屬目前僅存中國蓮（Nelumbo nucifera）和美洲蓮（Nelumbo lutea）。中國蓮和美洲蓮不存在生殖隔離，可以互相雜交[1]。美洲蓮花色和花型單一，中國蓮形態(tài)變異大，尤其在株型、花型、花色、花態(tài)等方面多樣性非常豐富，且品種數(shù)量遠(yuǎn)多于美洲蓮，是培育蓮新品種、研究遺傳多樣性的重要資源。但由于荷花的很多觀賞性狀如株高、花朵大小等多表現(xiàn)為數(shù)量性狀，是由多個(gè)基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，對其遺傳基礎(chǔ)的研究比較困難。

近年來，研究者采用RAPD、AFLP、ISSR等分子標(biāo)記方法，在評估野生荷花種質(zhì)或荷花不同地理群體的遺傳多樣性和親緣關(guān)系方面做了相關(guān)工作[3-7]。由于上述研究的群體和對象存在較大差異，采用的分子標(biāo)記技術(shù)也不同，使聚類情況較為復(fù)雜，部分研究并未檢測出豐富的遺傳多樣性[4-5]，其研究結(jié)果有待進(jìn)一步商榷。2013年，中國古代蓮全基因組序列的公布，為蓮功能基因組學(xué)、新基因挖掘提供了豐富的遺傳信息[8]。Yang等[9]從我國古代蓮的基因組序列中發(fā)現(xiàn)86 089個(gè)SSR motifs，測試開發(fā)了500對SSR引物，并利用這些新的引物構(gòu)建了亞洲蓮和美洲蓮的遺傳連鎖圖譜。這些報(bào)道在一定程度上有助于了解和掌握蓮種質(zhì)資源的遺傳背景。杜鳳鳳等[10]采用SSR標(biāo)記技術(shù)對42個(gè)荷花品種進(jìn)行了聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析，明確42個(gè)荷花品種的遺傳多樣性特征。楊郭陽[11]利用F1遺傳群體構(gòu)建了荷花遺傳連鎖圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測了株型相關(guān)QTLs位點(diǎn)。迄今為止，以荷花自然群體或種質(zhì)資源作為材料，研究荷花株型相關(guān)性狀的SSR關(guān)聯(lián)分析未見報(bào)道。

本研究以129份株型多樣性豐富的荷花群體為供試群體，利用多態(tài)性好的98對SSR引物，在分析遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行SSR標(biāo)記與立葉高度、花柄高度、立葉直徑等株型相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，旨在為荷花理想株型的構(gòu)建及培育微型或大型荷花新品種提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料來源于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所荷花種質(zhì)資源庫，地理坐標(biāo)為北緯32°04、東經(jīng)118°45;年平均溫度為15.7 ℃，年降雨量為1106.5 mm，年平均降雨天數(shù)為117 d。供試的129份中國蓮種質(zhì)名稱見表1。所有品種于2017年、2018年清明左右翻池，采用種藕繁殖，連續(xù)2年7—8月盛花期觀察記錄。

1.2 ?方法

1.2.1 ?表型數(shù)據(jù)的選取與測量 ?每個(gè)品種隨機(jī)選擇3株有代表性、無病蟲害、生長狀態(tài)良好的植株進(jìn)行觀察測量，觀察記錄花柄高度、立葉高度、立葉直徑等重要性狀。各指標(biāo)性狀具有不同的記錄標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)對質(zhì)量性狀予以賦值，對數(shù)量性狀進(jìn)行分級分類。利用SPASS和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 ?基因組DNA的提取和SSR分子標(biāo)記 ?采集供試樣品健康無病害的幼嫩葉片，利用組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（Aidlab）提取各樣品的基因組DNA;然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳和OneDrop分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度;再將其濃度稀釋至50 ng/μL，于?20 ℃保存?zhèn)溆??；谝褕?bào)道[8-9]的荷花遺傳連鎖圖譜和基因組信息，分別從遺傳圖譜的不同染色體上，選用多態(tài)性好且已開發(fā)的荷花SSR引物140對，隨機(jī)選擇5份供試荷花DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的98對引物用于全部荷花品種基因組DNA樣品的擴(kuò)增。采用ABI 3730XL對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，內(nèi)參Liz 500（Ic?lo?ning）。采用GeneMarker軟件對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行panel的編寫及條帶的判讀。

1.2.3 ?SSR數(shù)據(jù)處理與軟件分析 ?采用POPGENE 1.31軟件計(jì)算位點(diǎn)數(shù)（Na）、有效位點(diǎn)數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、觀測雜合度（Ho）、Neis期望雜合度（He）[12]。利用PowerMarker V3.25軟件基于Neis遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類圖[13]。利用STRUCTURE v2.2軟件分析基于混合模型的群體結(jié)構(gòu)[14]。

采用TASSEL v2.1軟件度量SSR位點(diǎn)間的連鎖不平衡水平，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不平衡系數(shù)（D）和決定系數(shù)（r2），繪制LD配對檢測的矩陣圖[15-16]。在表型性狀及群體結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡水平分析的基礎(chǔ)上，再次利用TASSEL v2.1軟件[17]的GLM（General Linear Model）程序，以各個(gè)體的Q值作為協(xié)變量進(jìn)行群體矯正，分別利用花柄高度、立葉高度、立葉直徑（長徑和短徑）等性狀數(shù)據(jù)對SSR分子標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析，估算標(biāo)記位點(diǎn)等位變異表型效應(yīng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?株型相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

選擇種質(zhì)圃株型差異較大的129份荷花品種進(jìn)行性狀統(tǒng)計(jì)。與株型相關(guān)的數(shù)量性狀分布情況及多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1，立葉高度變異范圍為7.5～141 cm，花柄高度變異范圍為18.5～160 cm，變異系數(shù)分別達(dá)39.68%和41.69%。立葉短徑、立葉長徑變異系數(shù)分別為29.70%和31.41%。由此可知，供試荷花群體株型的性狀變異豐富。

2.2 ?基于SSR擴(kuò)增的遺傳多樣性分析

利用多態(tài)性好、條帶清晰的98對SSR引物對129份蓮屬種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳熒光檢測、測序獲得等位基因數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析其遺傳多樣性參數(shù)。98對引物共擴(kuò)增得到537個(gè)位點(diǎn)（即總多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為537），每對引物擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)2～16個(gè)，平均每對引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為5.48個(gè)。有效位點(diǎn)數(shù)（Ne）最大達(dá)7.77（引物SSR065），最小為1.16（引物SSR400），平均值為2.58。Shannon信息指數(shù)（I）最大為2.32（引物SSR065），平均值為1.04;觀測雜合度（Ho）最大為1.00（引物SSR412、SSR240）;Neis期望雜合度（He）最大為0.87（引物SSR065）。引物SSR078的觀測雜合度（Ho）和Neis期望雜合度（He）均較大，分別為0.99和0.83。引物SSR463的Ho和He也均較大，分別為0.99和0.83（表2）。

2.3 ?UPGMA聚類分析

根據(jù)SSR分析數(shù)據(jù)計(jì)算各品種間的Neis遺傳距離，并進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果見圖2。其中‘姬妃蓮（119）、‘嵊縣粉蓮（117）、‘點(diǎn)額妝（126）、‘平頭紫（121）、‘普者黑白荷（81）等傳統(tǒng)品種最先被分類（圖2中的藍(lán)色部分），近年引入美洲蓮基因后培育出的雜交蓮品種‘六朝玉葉（80）、‘江南煙雨（78）、‘珠峰翠影（79）、‘秦淮翡翠（75）、‘洋貴人（76）、‘俊愉蓮13B（33）、‘金陵女神（83）、‘金陵暢想（96）、‘江南碧菡（59）、‘琴韻（70）、‘大師（77）等聚在一起（圖2中的紅色部分）。聚類結(jié)果出現(xiàn)了很多不同的亞群，且未發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類直接相關(guān)。分析其原因，一是蓮屬大多數(shù)品種是通過自然雜交和對實(shí)生苗連續(xù)多年的人工選育而來，其遺傳背景復(fù)雜、親本信息不明;二是在長期的歷史演化和人為育種選擇的過程中，中國蓮群體演化出了多個(gè)亞群。

2.4 ?群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用STRUCTURE V2.2軟件對供試蓮屬品種進(jìn)行基于混合模型的群體結(jié)構(gòu)分析。設(shè)定推測亞群數(shù)K=1～10，5個(gè)重復(fù)，根據(jù)運(yùn)行結(jié)果計(jì)算LnP（D）及ΔK值[18]，分別繪制LnP（D）和ΔK隨K值變化的散點(diǎn)圖。如圖3所示，LnP（D）隨K值的增大緩慢增大，并在K=10時(shí)有所降低，ΔK值在K=3時(shí)達(dá)到最大值。如圖4所示，當(dāng)K=3時(shí)，即推定供試群體具有3種遺傳組分，設(shè)定閾值為0.60，供試群體被分成4個(gè)亞群，分別為P1、P2、P3及混合群M1。P1亞群共包括10個(gè)品種，其中包括‘大師‘伯里王子等雜交蓮品種。P2亞群共67個(gè)品種。P3亞群共包括25個(gè)品種，其中包括‘平頭紫‘姬妃蓮‘解放紅蓮等傳統(tǒng)品種。剩余27個(gè)品種被分為混合群M1。

2.5 ?蓮屬重要性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記

以供試的129份種質(zhì)對應(yīng)的Q值為協(xié)變量，利用GLM模型分析與蓮表型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，結(jié)果顯示共找到11個(gè)標(biāo)記與花柄高度、立葉高度、立葉長徑、立葉短徑等4個(gè)性狀顯著相關(guān)（P<0.001），其中SSR067和SSR132分別與株型相關(guān)的4個(gè)性狀均顯著關(guān)聯(lián)。有5個(gè)標(biāo)記與花柄高度關(guān)聯(lián)，其中表型變異貢獻(xiàn)率最大的是SSR132（0.5818）;有7個(gè)標(biāo)記與立葉高度關(guān)聯(lián)，其中表型變異貢獻(xiàn)率最大的是SSR065（0.7264）;有6個(gè)標(biāo)記與立葉直徑（長徑和短徑）同時(shí)關(guān)聯(lián)，其中表型變異貢獻(xiàn)率最大的是SSR132（0.6706和0.6424）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一標(biāo)記可與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)，如SSR067、SSR132、SSR458標(biāo)記均與花柄高度、立葉高度、立葉長徑、立葉短徑等性狀相關(guān)聯(lián)，可能由于基因連鎖或者一因多效引起的。在連續(xù)2年的重復(fù)試驗(yàn)中，SSR132和SSR458標(biāo)記均可與立葉長徑、立葉短徑相關(guān)聯(lián)，這2個(gè)位點(diǎn)受環(huán)境影響可能較小（表3）。

3 ?討論

群體遺傳結(jié)構(gòu)的解析對于種質(zhì)資源的利用非常重要。迄今為止，很多園藝植物的群體結(jié)構(gòu)已有相關(guān)報(bào)道[19-21]。在本研究中，UPGMA聚類分析表明供試蓮群體內(nèi)部存在不同亞群，其遺傳背景較為復(fù)雜，STRUCTURE軟件群體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。群體結(jié)構(gòu)分析可較好的區(qū)分傳統(tǒng)品種與亞美雜交蓮品種。在最大的亞群P2中，其遺傳組分較為復(fù)雜，可能由于地理分割或者歷史演化在群體內(nèi)部產(chǎn)生了多個(gè)亞群。此外，有27個(gè)品種被分為混合群M1，可能與長期雜交育種過程中的基因漸滲有關(guān)[10]。

荷花的株型、花期等性狀易受環(huán)境影響，與氣候和栽培條件均有較大關(guān)系，這些性狀的復(fù)雜性容易影響不同年份的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。Yang等[22]利用AFLP、SRAP和SSR標(biāo)記挖掘荷花花朵觀賞性狀和花期相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個(gè)標(biāo)記可以和連續(xù)兩年的花瓣數(shù)相關(guān)聯(lián)，而對于始花期和花期性狀來講，很多標(biāo)記在兩年的數(shù)據(jù)觀測中，都僅有一年與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)，推測花期性狀可能受環(huán)境影響較大。在本研究中，一共找到11個(gè)標(biāo)記與荷花花柄高度、立葉高度、立葉長徑、立葉短徑等4個(gè)性狀顯著相關(guān)。有2個(gè)標(biāo)記可以連續(xù)兩年與立葉長徑、立葉短徑相關(guān)聯(lián)，而花柄高度、立葉高度這2個(gè)性狀均只有一年可以與標(biāo)記顯著關(guān)聯(lián)。這一結(jié)果可能由于氣候或環(huán)境因素造成不同年份關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的差異。雖然以上發(fā)現(xiàn)的株型相關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在一定程度上受環(huán)境因素的影響，但這些位點(diǎn)的挖掘?yàn)樯彽闹晷透牧继峁┝艘罁?jù)，在今后的研究中，可采用高密度遺傳圖譜對這些重要位點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 王其超， 張行言. 中國荷花品種圖志： 續(xù)志[M]. 北京： 中國建筑工業(yè)出版社， 1999.

[2] 張行言， 陳龍清， 王其超. 中國荷花新品種圖志[M]. 北京：中國林業(yè)出版社， 2011.

[3] Fu J， Xiang Q， Zeng X B， et al. Assessment of the genetic diversity and population structure of lotus cultivars grown in China by amplified fragment length polymorphism[J]. Journal of American Society Horticultural Science， 2011， 136： 339-349.

[4] Chen Y Y， Zhou R C， Lin X C， et al. ISSR analysis of genetic diversity in sacred lotus cultivars[J]. Aquatic Botany， 2008， 89（3）： 311-316.

[5] Hu J H， Pan L， Liu H G， et al. Comparative analysis of genetic diversity in sacred lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.） using AFLP and SSR markers[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（4）： 3637-3647.

[6] Li Z， Liu X Q， Gituru R W， et al. Genetic diversity and classification of Nelumbo germplasm of different ori-gins by RAPD and ISSR analysis[J]. Scientia Horticulturae， 2010， 125（4）： 724-732.

[7] Yang M， Han Y N， Xu L M， et al. Comparative analysis of genetic diversity of lotus （Nelumbo） using SSR and SRAP markers[J]. Scientia Horticulturae， 2012， 142： 185- 195.

[8] Ming R， VanBuren R， Liu Y L， et al. Genome of the long-living sacred lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.）[J]. Genome Biology， 2013， 14（5）： 131-143.

[9] Yang M， Han Y N， VanBuren R， et al. Genetic linkage maps for Asian and American lotus constructed using novel SSR markers derived from the genome of sequenced cultivar[J]. BMC Genomics， 2012， 13（1）： 1471-2164.

[10] 杜鳳鳳， 劉曉靜， 常雅軍， 等. 基于SSR標(biāo)記的荷花品種遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2016， 25（1）： 9-16.

[11] 楊郭陽. 荷花遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及株型相關(guān)性狀QTLs分析[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

[12] Yeh F C， Yang R C， Boyle T. Popgene Version 1.31 Quick User Guide[M]. Canada： University of Alberta， and Centre for International Forestry Research， 1999.

[13] Liu K， Muse S V. PowerMarker： An integrated analysis environment for genetic marker analysis[J]. Bioinformatics， 2005， 21（9）： 2128-2129.

[14] Evanno G， Regnaut S， Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE： A simulation study[J]. Molecular Ecology， 2005， 14（8）： 2611-2620.

[15] Gaut B S， Long A D. The lowdown on linkage disequilibrium[J]. Plant Cell， 2003， 15（7）： 1502-1506.

[16] Flint-Garcia S A， Thornsberry J M， Buckler E S. Struc-ture of linkage disequilibrium in plants[J]. Annual Review of Plant Biology， 2003， 54： 357-374.

[17] Bradbury P J， Zhang Z W， Kroon D E， et al. TASSEL： Software for association mapping of complex traits in diverse samples[J]. Bioinformatics， 2007， 23（19）： 2633-2635.

[18] Pritchard J K， Stephens M， Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics， 2000， 155（2）： 945-959.

[19] Gawenda I， Schrder-Lorenz A， Debener T. Markers for ornamental traits in Phalaenopsis orchids： Population structure， linkage disequilibrium and association mapping[J]. Molecular Breeding， 2012， 30（1）： 305-316.

[20] Song B H， Windsor A J， Schmid K J， et al. Multilocus patterns of nucleotide diversity， population structure and linkage disequilibrium in Boechera stricta， a wild relative of Arabidopsis[J]. Genetics， 2009， 181（3）： 1021-1033.

[21] Zhang F， Ge Y Y， Wang W Y， et al. Genetic diversity and population structure of cultivated bromeliad accessions assessed by SRAP markers[J]. Scientia Horticulturae， 2012， 141： 1-6.

[22] Yang M， Zhu L， Xu L， et al. Population structure and association mapping of flower-related traits in lotus （Nelumbo Adans.） accessions[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 175： 214-222.

收稿日期? 2019-11-11;修回日期? 2020-03-23

基金項(xiàng)目 ?農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（No. KF201802）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[No. CX（16）1024]。

作者簡介? 楊? 丹（1996—），女，碩士研究生，研究方向：植物資源學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：劉曉靜（LIU Xiaojing），E-mail：liuxiaojingcau@126.com;姚東瑞（YAO Dongrui），E-mail：shuishengzu@126.com。