鄭 琪，李 欣，任根深，王亞翠，王 勇，張愛民

(1.平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅平?jīng)?744000； 2.植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所/種子創(chuàng)新研究院，北京 100101)

品質(zhì)改良是當(dāng)前小麥育種的重要目標(biāo)，也是促進(jìn)小麥供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、提升產(chǎn)業(yè)競爭力的重要因素[1]。近年來，小麥面包加工品質(zhì)的改良已成為各地小麥育種的重要目標(biāo)之一[2]。一般情況下，只有通過烘烤制作并測定面包品質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)方可評價一個品種是否為優(yōu)質(zhì)面包小麥品種。烘烤測試只能在育種后期有足夠多的籽粒磨粉才能進(jìn)行，并且受季節(jié)和環(huán)境等因素的影響，試驗(yàn)的重復(fù)性比較低[3]。截至目前，通過測定小麥品種籽粒儲存蛋白質(zhì)含量、高分子量谷蛋白亞基類型以及面粉沉降值、farinogram(粉質(zhì)圖)吸水率、mixogram(和面圖)峰值等指標(biāo)快速檢測小麥面包加工品質(zhì)的報道較多[4-11]，但針對小麥面包加工品質(zhì)關(guān)鍵基因的研究報道較少。Furtado等[12]研究發(fā)現(xiàn)，wbm(wheat bread making)基因編碼一個含有48個氨基酸(含4個半胱氨酸殘基)的蛋白質(zhì)，含有wbm基因的小麥品種具有很好的面包制作品質(zhì)，并開發(fā)了wbm檢測標(biāo)記。該標(biāo)記可以快速有效地檢測小麥基因組中是否存在wbm基因。wbm基因高表達(dá)的基因型小麥品種均具有良好的面包品質(zhì)，但不一定具有良好的面團(tuán)品質(zhì)[12]。Carlos等[13]研究證實(shí)，wbm基因的表達(dá)對面筋品質(zhì)、面筋強(qiáng)度、面筋的延展性和面包品質(zhì)均有顯著的正向效應(yīng)，但其效應(yīng)小于Glu-D1、Glu-B1等基因的表達(dá)效應(yīng)。由于wbm基因的片段較小(961 bp)，在小麥基因庫中出現(xiàn)的幾率低，前人將其與小麥品質(zhì)聯(lián)系起來進(jìn)行研究的報道很少。本研究利用wbm標(biāo)記檢測國內(nèi)外部分優(yōu)質(zhì)小麥品種，分析wbm基因的分布與遺傳變異，以期發(fā)掘可供選育優(yōu)質(zhì)面包小麥品種的優(yōu)良種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為196個國內(nèi)外小麥品種(系)，其中，國內(nèi)品種(系)104個，主要來自國內(nèi)新育成或當(dāng)前主栽的優(yōu)質(zhì)小麥品種(系)和部分中國微核心種質(zhì)，冬性品種57個，春性品種47個；巴基斯坦優(yōu)質(zhì)面包小麥品種(系)92個，全部為春性品種(系)。具體品種(系)名稱見表1和表2。

1.2 面包加工基因分子標(biāo)記及引物

小麥面包加工基因標(biāo)記的PCR引物對為NWPFor(5′-CCGTCACAAGATTTACAGGGT TG-3′)和NWPRev(5′-TTATGGATCTCTTT ATGTCTGTGT-3′)，該標(biāo)記位于7L染色體上[12]。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取小麥幼苗中基因組總DNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq Master Mix 10 μL、上下游引物(5 μmol·L-1)各1.5 μL、ddH2O 6 μL和模板DNA(100 ng·μL-1)1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國小麥品種中wbm基因的分布

利用引物NWPFor和NWPRev對來自新疆、甘肅、寧夏、四川以及黃淮流域的104個中國小麥品種(系)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果(圖1、表1)表明，在57個冬小麥品種(系)中未檢測到wbm基因，在47個春小麥品種(系)中，有2個品種含有wbm基因，即阿春2號和寧春40。104個中國小麥品種(系)攜帶wbm基因的比例僅為1.9%。說明該基因在中國小麥品種中出現(xiàn)的頻率很低。

M：DNA ladder;1：Munal#1(陽性對照，含wbm基因)；2：KAChu#1(陰性對照)；3：阿春2號；4：川麥104；5：川麥42；6：創(chuàng)星8號；7：藁優(yōu)5766；8：濟(jì)麥24；9：隴春22；10：隴春36；11：綿麥367；12：綿麥37；13：寧春40號；14：寧春53號；15：農(nóng)大3753；16：師欒02-1；17：西農(nóng)979；18：新春28號；19：新春40號；20：新麥26；21：鄭麥366；22：中優(yōu)206；23：中麥255；24：周麥26。

表1 104個中國小麥品種(系)中wbm基因的分布

2.2 巴基斯坦小麥品種中wbm基因的分布

利用引物NWPFor和NWPRev對巴基斯坦92個小麥品種(系)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果(表2，圖2)表明，有8個品種含有wbm基因(圖2)，這8個品種為Anmol-91、BHAKKAR-2000、Imdad-2005、IQBAL-2000、MIRAJ-08、Moomal-2002、SINDHU16和WATAN。92個巴基斯坦小麥品種(系)全部為春性，攜帶wbm基因的比例為8.7%。說明該基因在巴基斯坦春性小麥品種中出現(xiàn)的頻率相對較高。

表2 92份巴基斯坦春小麥品種(系)中wbm基因的分布

M:DNA ladder; 1:Munal#1(positive control with wbm gene); 2:KAChu#1(negative control); 3:Abadgar-93; 4:Anmol-91; 5:BHAKKAR-2000; 6:BHITTAI; 7:CHAKWAL-97; 8:FAISALABAD 85; 9:Hamal-2012; 10:Imdad-2005; 11:LASANI-08; 12:IQBAL-2000; 13:Mehran-89; 14:MEHRAN-89; 15:MH97; 16:MIRAJ-08; 17:Moomal-2002; 18:NAEEM 82; 19:PAK-81; 20:PASTOR; 21:SINDHU16; 22:SKD-1; 23:WATAN; 24:ZAMINDAR-80.

2.3 wbm基因遺傳分析

Furtado等[12]認(rèn)為，來自澳大利亞的WW-15和Condor小麥品種是wbm基因的最初供體，這兩個品種是國際小麥玉米改良中心(Centro Internacional de Mejoramientode Maizy Trigo，CIMMYT)小麥育種普遍使用的親本材料，并且CIMMYT利用它們已經(jīng)選育出具有高表達(dá)wbm基因的優(yōu)質(zhì)面包小麥品種。Guzman等[13]研究表明，來自CIMMYT的Munal#1的親本W(wǎng)AXWING和KIRITATI均含有wbm基因，且其親本也是CIMMYT面包小麥種質(zhì)資源中wbm基因的供體。本研究對含有wbm基因小麥品種的系譜、類型和來源調(diào)查(表3)發(fā)現(xiàn)，面包加工品質(zhì)基因在春小麥品種中分布較廣，巴基斯坦小麥品種中分布的頻率高于中國。攜帶wbm基因的巴基斯坦和中國春小麥品種親本中大多都含有CIMMYT的種質(zhì)資源。由此可以推斷，wbm基因的最初供體是來自澳大利亞的WW-15或Condor，這兩個種質(zhì)資源被引入CIMMYT后，又被傳到巴基斯坦和中國的小麥品 種中。

表3 含有wbm基因品種的系譜、類型及來源

3 討 論

從小麥及其近緣植物中發(fā)掘新的優(yōu)質(zhì)基因，通過分子標(biāo)記輔助選擇聚合優(yōu)質(zhì)基因的小麥品種是小麥品質(zhì)改良的重要途徑之一。wbm基因自2015年被報道以來，在一部分CIMMTY種質(zhì)和澳大利亞小麥品種中也被發(fā)現(xiàn)[12-13]，但頻率很低。本研究通過檢測104個中國小麥及92個巴基斯坦春小麥品種中wbm基因的分布，發(fā)現(xiàn)在國內(nèi)外小麥品種中，wbm基因出現(xiàn)的頻率也很低 (5.3%)。其中，在中國小麥中的分布頻率為1.9%；在巴基斯坦小麥中品種的分布頻率為8.7%。Rasheed等[14]對來自世界范圍內(nèi)的4 000余個小麥品種(系)及種質(zhì)資源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)wbm基因的分布頻率也很低，在150個美國小麥品種、94個四倍體材料和267個小麥中國微核心種質(zhì)中均不含wbm基因，在1 840個中國小麥品種(系)中僅5個含有wbm基因[14]。本研究在45個中國微核心種質(zhì)中也均未檢測到wbm基因，與前人研究結(jié)果一致。極低的分布頻率表明，wbm基因尚未經(jīng)人工選擇應(yīng)用在現(xiàn)代小麥品種中，通過分子標(biāo)記輔助選擇，或者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可將優(yōu)質(zhì)wbm基因?qū)脒m宜的小麥品種(系)中，并開發(fā)優(yōu)質(zhì)小麥新材料，培育優(yōu)質(zhì)小麥新品種。

決定小麥加工品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，人們長期將小麥品質(zhì)與其所含高分子量谷蛋白亞基的數(shù)量和種類相關(guān)聯(lián)。近年來研究表明，wbm基因編碼一個富含硫的小分子量蛋白，在面包品質(zhì)好的小麥品種中表達(dá)量較高，可能在谷蛋白和醇溶蛋白形成交聯(lián)時發(fā)揮作用[12,15]。Guzman等[13]研究表明，wbm基因顯著影響面筋品質(zhì)、面筋強(qiáng)度、面筋的延展性和面包品質(zhì)。Rasheed等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與不含wbm基因的小麥品種綿麥37相比，含有wbm基因的小麥品種綿麥1419的面團(tuán)延展性和面包體積均有明顯改善[14]。鄭 琪等[16]研究發(fā)現(xiàn)，含有wbm基因的小麥中，對面包加工品質(zhì)有正向作用的高分子量谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基2*、17+18、7+8、5+10等分布的頻率也較高，同時在優(yōu)質(zhì)面包小麥藁優(yōu)8901和藁優(yōu)2018中并不含wbm基因。因此，為了選育具有優(yōu)良面包加工品質(zhì)的小麥品種，在選擇具有優(yōu)良的高分子量和低分子量麥谷蛋白基因組合的同時，還應(yīng)考慮wbm基因，不僅可以改善面包品質(zhì)，而且豐富了遺傳基因多樣性。

本研究結(jié)果表明，攜帶wbm基因的小麥主要為春性品種，包括2個中國小麥品種(阿春2號、寧春40)和8個巴基斯坦小麥品種，均是新發(fā)現(xiàn)的攜帶wbm基因的材料。實(shí)際上冬性品種也有攜帶wbm基因的材料。Rasheed等[14]對 2 000余個中國小麥品種(系)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有7個中國材料(川麥38、川麥82、14046、1190722、周11595-5-1-2、晉麥67和新冬21號)攜帶有wbm基因。其中，川麥38和川麥82是春性品種，其系譜來自CIMMYT和人工合成種的材料；新冬21號和晉麥67是冬性小麥品種，從系譜分析來看, 其親本和CIMMYT種質(zhì)關(guān)系不大，推測wbm基因來源可能是多樣化的。