何夢嬌， 李麗生， 陳玉玲， 駱凱

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 福建省高校口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建 福州（350002）； 2.福建省立醫(yī)院急診外科，福建 福州（350001）

理想的牙周組織再生應(yīng)包含牙槽骨再生、新生牙骨質(zhì)形成及位于兩者間的新生牙周韌帶［1］。傳統(tǒng)的牙周治療方法如齦上潔治、齦下刮治、根面平整及手術(shù)治療多以形成長結(jié)合上皮為主要愈合方式，較少獲得真正的牙周組織再生。其他再生治療方法如植骨術(shù)、引導(dǎo)組織再生術(shù)等盡管可獲得不同程度的牙周新附著，尚不能實現(xiàn)理想的牙周組織再生。

近年來，細(xì)胞療法逐漸引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注并應(yīng)用于臨床。細(xì)胞膜片技術(shù)（cell sheet technology，CST）是一種無需支架的細(xì)胞移植方法，可無創(chuàng)性地獲取細(xì)胞，避免了酶消化對細(xì)胞生物學(xué)功能的損傷，不僅保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），同時還保留了重要離子通道和生長因子受體等，可以促進(jìn)細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用［2］。近年來，CST 廣泛應(yīng)用于組織與器官重建，包括角膜［3］、骨［4］、牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體［5］等。在某些領(lǐng)域，已有將CST 應(yīng)用到臨床試驗階段［3］。2005 年以來，學(xué)者們陸續(xù)報道將CST 應(yīng)用于牙周再生治療［6-7］，通過構(gòu)建各種類型細(xì)胞來源的細(xì)胞膜片用于牙周組織再生并進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)外研究。本文將就細(xì)胞膜片的種類、構(gòu)建方法及其在牙周組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用及研究進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)胞膜片的種類

1.1 單層細(xì)胞膜片

單層細(xì)胞膜片是一種二維結(jié)構(gòu)，由單層細(xì)胞及其胞外基質(zhì)構(gòu)成，可直接移植至受體組織。單層細(xì)胞膜片對操作者的要求較高，培養(yǎng)過程中若不及時將膜片刮下，成熟后膜片會自動收縮成團(tuán)。此外，由于其為單層結(jié)構(gòu)，從培養(yǎng)皿分離時容易破損，分離后的膜片容易收縮、起皺、折疊。雖然移植過程中使用增強(qiáng)型載體復(fù)合于膜片上可在一定程度上維持細(xì)胞膜片大小，增強(qiáng)其物理和機(jī)械性能［6］，但同時也存在載體材料降解及宿主反應(yīng)等不利問題。

1.2 多層細(xì)胞膜片

當(dāng)多層細(xì)胞膜片相互疊加后，沉積于膜片之間的胞外基質(zhì)即可迅速開始相互作用并形成可用于組織再生的高細(xì)胞含量組織。細(xì)胞膜片的多層疊加有助于增強(qiáng)膜片的機(jī)械性能，使移植細(xì)胞更快適應(yīng)靶位點的微環(huán)境。Mu 等［8］在溫敏反應(yīng)培養(yǎng)皿上成功制備出三層人下頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）膜片，自體移植到拔牙位點可促進(jìn)骨再生，但是移植物的厚度應(yīng)該控制在一定范圍內(nèi)以避免出現(xiàn)細(xì)胞壞死［9］。

1.3 細(xì)胞膜片片段（cell sheet fragment，CSF）

CSF 通過將薄細(xì)胞膜片切成小片（直徑約1 mm）制備成可注射的細(xì)胞釋放載體。它可以降低某些部位的操作難度與風(fēng)險進(jìn)而提高細(xì)胞移植治療的效率。據(jù)報道［10］，聯(lián)合支架材料的骨髓基質(zhì)細(xì)胞膜片片段可促進(jìn)骨形成，為CST 在牙周組織再生中的應(yīng)用提供新方向。

1.4 細(xì)胞膜片聚合體

細(xì)胞膜片聚合體是基于細(xì)胞膜片制備的三維結(jié)構(gòu)，可提供強(qiáng)有力的機(jī)械支持，提高細(xì)胞膜片的穩(wěn)定性。然而，構(gòu)建大結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜片聚合體時，如何提高聚合體內(nèi)的細(xì)胞生物活性和營養(yǎng)供應(yīng)仍值得進(jìn)一步探討。Yang 等［11］報道連續(xù)誘導(dǎo)14 d 可制備出單層牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）膜片，再次培養(yǎng)7 d 即可獲得PDLSCs聚合體，該聚合體的異位移植能夠再生出牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。然而，延長聚合體的體外培養(yǎng)時間至10 d，聚合體內(nèi)部可出現(xiàn)數(shù)量不等的空隙樣結(jié)構(gòu)，這可能與聚合體內(nèi)部營養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致組織壞死有關(guān)。

2 細(xì)胞膜片的構(gòu)建方法

2.1 羊膜基底膜法

羊膜是胎盤的最內(nèi)層，女性分娩后常將羊膜作為醫(yī)療垃圾而被丟棄，因此，羊膜易于獲取。羊膜基底膜和羊膜基質(zhì)層含有IV 型膠原、層黏連蛋白等成分，尤其是羊膜具有抗菌、抗纖維化、抑制新生血管生成［12］及合適的機(jī)械性能等特性，使得羊膜可以充當(dāng)“移植的基底膜”而作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)［13］。此外，羊膜可降低疼痛及炎癥反應(yīng)，抑制疤痕形成，呈現(xiàn)低免疫原性。報道顯示將細(xì)胞按一定的密度接種于處理后的羊膜上，置于插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)2～3 周即可獲得細(xì)胞膜片［14］。

2.2 溫度敏感性培養(yǎng)皿法

該方法將表面改性的溫敏反應(yīng)性聚合材料——聚N-異丙基丙烯酰［poly（N-isopropylacrylamide），PNIPAAm］涂抹在普通培養(yǎng)皿底部，再將細(xì)胞接種到材料表面構(gòu)建細(xì)胞膜片。該材料最早由Okano 等［15］合成，用以控制細(xì)胞表面黏附。當(dāng)溫度高于32 ℃時，PNIPAAm 呈疏水性，可促進(jìn)細(xì)胞黏附；而當(dāng)溫度低于32 ℃，PNIPAAm 呈親水性，結(jié)構(gòu)致密，易于分離，阻止細(xì)胞黏附。PNIPAAm 的多孔結(jié)構(gòu)使其成為優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)皿材料，僅通過溫度變化便可獲取完整的細(xì)胞及ECM。由此獲得的細(xì)胞膜片為單層細(xì)胞膜片，保留了細(xì)胞表面的一些重要蛋白及ECM，但膜片薄，操作性能差，操作過程復(fù)雜，特殊設(shè)備價格昂貴。

2.3 維生素C 連續(xù)誘導(dǎo)法

將一定密度細(xì)胞接種于普通培養(yǎng)皿，加入適當(dāng)濃度的維生素C，2～3 d 更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)2周左右，可通過細(xì)胞刮、移液器、鑷子、青霉素瓶蓋、橡膠塞等由外周向中心沿底壁仔細(xì)分離，獲得完整的細(xì)胞膜片。此方法簡單易行，無需特殊材料或方法，獲得的細(xì)胞膜片由多層細(xì)胞及ECM 構(gòu)成，一定的厚度賦予膜片相應(yīng)的彈性和較穩(wěn)定的機(jī)械性能，增強(qiáng)其操作性。本課題組前期研究采用維生素C 連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)成功構(gòu)建出富含細(xì)胞外基質(zhì)的骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞膜片［16］。

2.4 磁力組織工程法

磁力組織工程法將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸共軛的肽磁鐵礦陽離子脂質(zhì)體添加至由親水性和中性共價水凝膠層組成的24 孔培養(yǎng)板表面，培養(yǎng)板下面放置一塊圓柱形釹磁鐵提供垂直磁力，以促進(jìn)細(xì)胞黏附。構(gòu)建時，種子細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底層黏附、伸展和增殖，形成連續(xù)的細(xì)胞膜片。細(xì)胞培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)皿底的磁鐵，此時的細(xì)胞膜片含有磁性納米粒子，可將磁鐵棒伸入培養(yǎng)孔收獲細(xì)胞片［17］。以磁力分離細(xì)胞片，可減少細(xì)胞損傷，但存在細(xì)胞培養(yǎng)過程復(fù)雜，部分磁性物質(zhì)殘留細(xì)胞膜片中的缺點。

3 CST 在牙周組織再生中的應(yīng)用

隨著牙周組織再生研究的深入，當(dāng)前有多種細(xì)胞可做為種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片實現(xiàn)牙周組織的再生。細(xì)胞膜片在牙周組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用可采用以下3 種模式：單層細(xì)胞膜片直接移植到受區(qū)位點，構(gòu)建牙周組織［6-7］；同種或異種多層細(xì)胞膜片疊加后移植到受區(qū)位點，構(gòu)建牙周組織［9］；同種多層細(xì)胞膜片包裹支架材料后移植到受區(qū)位點，構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)組織［18］。

3.1 PDLCs 膜片

PDLCs 具有多分化潛能，現(xiàn)有的研究表明牙周膜來源的細(xì)胞對牙周組織再生至關(guān)重要［19］。隨著CST 的發(fā)展，PDLCs 膜片的研究引起廣泛關(guān)注。Akizuki 等［6］制備自體單層PDLCs 膜片與透明質(zhì)酸復(fù)合后移植到beagle 犬第一磨牙近中根牙周骨缺損，實驗組并沒有出現(xiàn)預(yù)期估計的完全再生可能是移植過程中膜片與根面的貼附不穩(wěn)定，提示細(xì)胞膜片與移植區(qū)的充分接觸是確保CST 修復(fù)牙周組織缺損療效的關(guān)鍵。研究人員為進(jìn)一步提高膜片的機(jī)械性能和可操作性，制備了多層膜片，結(jié)果表明成骨誘導(dǎo)后的多層膜片修復(fù)效果更為理想。Xu 等［20］研究提示在細(xì)胞膜片工程中，可通過加入某種生長因子以加快體外膜片形成并促進(jìn)膜片體內(nèi)分化能力。有臨床研究［21］選取10 位牙周炎患者，取其第三磨牙的PDLSCs 制備三層細(xì)胞膜片，并移植到牙周缺損的根面，β-TCP 填滿骨缺損，移植6 個月后10 個病例均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，且發(fā)現(xiàn)牙周探診深度減少，附著水平增加，CBCT 示骨密度增加。因此，基于細(xì)胞膜片技術(shù)的細(xì)胞療法修復(fù)牙周缺損被證實是安全有效的，且該有效性在中長期的隨訪中保持穩(wěn)定。

3.2 BMSCs 膜片

BMSCs 是存在于骨髓中的一類多能干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。迄今為止，BMSCs 是骨組織工程中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞系。BMSCs 不僅可以有效修復(fù)骨缺損，亦可以實現(xiàn)牙周組織再生［22］。Lin 等［23］的研究證實BMSCs膜片與β-TCP/COL-I 支架協(xié)同促進(jìn)骨形成，細(xì)胞膜片復(fù)合β-TCP/COL-I 支架在骨組織工程表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景。有學(xué)者［24］對比了年輕及年老BMSCs、BMSCs 膜片的成骨能力，結(jié)果表明年老的BMSCs 膜片同樣可促進(jìn)骨形成，為年老患者提供了潛在有效的細(xì)胞療法。

血管化是組織再生成功的關(guān)鍵，有學(xué)者通過血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）誘導(dǎo)兔BMSCs 分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞（endothelial cells，ECs），并將此ECs 接種在BMSCs 膜片上形成血管化ECs/BMSCs 細(xì)胞膜片，體外及體內(nèi)實驗均發(fā)現(xiàn)該預(yù)血管化結(jié)構(gòu)可促進(jìn)血管形成。研究結(jié)果提示，BMSCs 可作為內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞膜片的種子細(xì)胞構(gòu)建預(yù)血管化細(xì)胞膜片促進(jìn)組織再生［25］。

3.3 牙囊細(xì)胞（dental follicle cells ，DFCs）膜片

DFCs 是PDLCs 的前體細(xì)胞，在細(xì)胞干性、增殖分化能力等方面具有相對優(yōu)勢。體外研究證實DFCs 膜片表現(xiàn)出比較全面的牙周組織向分化能力，而PDLCs 膜片表現(xiàn)出較強(qiáng)的成骨向分化能力。兩種膜片復(fù)合牙本質(zhì)基質(zhì)在裸鼠皮下均可形成牙周組織樣結(jié)構(gòu)，而且DFCs 膜片比PDLCs 膜片具有更強(qiáng)、更全面的牙周組織向分化能力。因此，DFCs 膜片可能在將來牙周組織再生中有更多優(yōu)勢。

3.4 共培養(yǎng)的細(xì)胞膜片

有研究認(rèn)為單一細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞膜片無法保證膜片的功能和生物學(xué)活性，因為單一細(xì)胞直接相互作用不及多細(xì)胞組織有效［26］。在牙周韌帶或機(jī)體其他組織中干細(xì)胞的數(shù)量實際并不多，添加不同類型干細(xì)胞或者其他輔助細(xì)胞可促進(jìn)組織樣材料的有效構(gòu)建，進(jìn)而促進(jìn)體內(nèi)組織再生和修復(fù)。因此，學(xué)者們提出了將不同類型細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)種子細(xì)胞時恢復(fù)異型細(xì)胞間的相互作用以實現(xiàn)牙周膜的完全再生，尤其是實現(xiàn)功能性和血管化再生。Zhang 等［27］的研究證實PDLSCs 和BMSCs 復(fù)合膜片可作為功能性牙周組織再生的新方法。李欣等［28］將DFCs 膜片、PDLCs 及以上2 種細(xì)胞的復(fù)合膜片混合支架材料同種異體植入比格犬牙周缺損模型，所有膜片移植組均可獲得一定的牙周再生效果，但只有復(fù)合膜片移植組能獲得完整的牙骨質(zhì)、牙槽骨及規(guī)則的牙周膜樣結(jié)構(gòu)。

4 小 語

單層細(xì)胞膜片的機(jī)械性能欠佳，可操作性較差，與外源性支架復(fù)合后可以實現(xiàn)包括牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)在內(nèi)的牙周組織再生，但支架材料存在潛在的免疫源性、較低的生物活性、不匹配的降解速率以及難以控制的細(xì)胞與材料間的交互作用等缺陷。采用同種或異種細(xì)胞膜片疊加構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)可避免支架材料帶來的問題，但所構(gòu)建的多層膜片可能由于缺乏完善的血供，導(dǎo)致膜片內(nèi)部微環(huán)境變化，干擾細(xì)胞代謝，甚至引起細(xì)胞的死亡。如何平衡膜片工程再生的細(xì)胞活性和力學(xué)性能之間的矛盾至關(guān)重要。此外，細(xì)胞膜片的生物活性在很大程度上依賴于種子細(xì)胞的狀態(tài)。對于牙周組織再生來講，狀態(tài)不佳的種子細(xì)胞將無法獲得良好的再生效果。因此，在選擇合適的種子細(xì)胞的同時如何保證種子細(xì)胞具有良好的狀態(tài)也是構(gòu)建細(xì)胞膜片中應(yīng)關(guān)注的重要問題?？傊?，CST在牙周組織再生方面有廣泛的應(yīng)用前景，隨著CST本身的不斷改進(jìn)和完善，CST 有望實現(xiàn)牙周組織的完全再生。