国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

朝鮮當(dāng)歸提取物對小鼠腦缺血-再灌注損傷神經(jīng)的保護(hù)作用及其機(jī)制*

2020-01-06 03:19程永杰趙子瑞李曉妮吉海杰
醫(yī)藥導(dǎo)報 2020年1期
關(guān)鍵詞:通透性屏障提取物

程永杰,趙子瑞,李曉妮,吉海杰

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,太原 030031;2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,太原 030001;3.山西省中醫(yī)藥研究院,太原 030012)

腦卒中是世界范圍內(nèi)威脅公眾健康的疾病之一。缺血性腦卒中病灶由缺血核心區(qū)及周圍缺血半影區(qū)組成;缺血核心區(qū)神經(jīng)元損傷不可逆,而半影區(qū)損傷能夠通過及時治療得到挽救[1]。新生血管生成可使阻塞微血管再通,促進(jìn)半影區(qū)損傷神經(jīng)元恢復(fù)[2]。血管生成是由血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)等調(diào)節(jié)[3]。研究表明,小鼠腦卒中后全身炎癥加劇,可降低血-腦屏障緊密連接[4]。VEGF可促進(jìn)血管生成,抑制缺血神經(jīng)元損傷,還具有抗炎作用[5]。Ang-1是內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體Tie-2配體[6]。Ang-1和VEGF聯(lián)合具有協(xié)同作用,促進(jìn)血管生成和新生血管成熟。朝鮮當(dāng)歸(AngelicagigasNakai)為傘形科植物朝鮮當(dāng)歸的根。朝鮮當(dāng)歸主要含紫花前胡素、紫花前胡醇當(dāng)歸酯、7-去甲基軟木花椒素、異紫花前胡內(nèi)酯和紫花前胡醇[7]。朝鮮當(dāng)歸具有一些生物活性,如神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗氧化等[8-9]。然而,朝鮮當(dāng)歸對血-腦屏障通透性和血管生成影響筆者未見相關(guān)報道。因此,本研究旨在評價朝鮮當(dāng)歸提取物是否通過調(diào)節(jié)血-腦屏障通透性和血管生成在小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)誘導(dǎo)缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R) 損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 雄性清潔級C57BL/6小鼠,體質(zhì)量25~30 g,自由飲食和飲水,室溫(23±1) ℃。所有動物均由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(晉) 2015 -0001。將小鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,分別為假手術(shù)組、模型對照組和朝鮮當(dāng)歸(10,25,50,100 mg·kg-1)組,每組各9只。

1.2試劑 朝鮮當(dāng)歸(亳州市保華藥業(yè)有限公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenylterazolium chloride,TTC)染料(美國Sigma公司,批號:00281342);Ang-1(美國Santa公司,批號:SC-319824);VEGF(美國Santa公司,批號:SC-7269);CAM-1(美國Santa公司,批號:SC-7974);ZO-1(美國Santa公司,批號:I0214);Occludin(美國Santa公司,批號:SC-8144)。

1.3方法

1.3.1朝鮮當(dāng)歸提取物的制備 將朝鮮當(dāng)歸根部用純化水煮3 h,通過雙層濾網(wǎng)過濾到Whatman濾紙(杭州雷琪實驗儀器有限公司,型號:2105-862)上,在真空下濃縮。最終產(chǎn)生的濃縮提取物是29.1%干燥粉末,干燥粉末在4 ℃冰箱中保存,使用前溶解于0.9%氯化鈉溶液中。

1.3.2I/R模型制備 小鼠I/R模型制備方法:1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,然后頸部行正中縱切口,顯微鏡下暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,用絲線結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠(yuǎn)心端,將線栓從小孔插入頸總動脈,上升至頸內(nèi)動脈,最后到達(dá)大腦中動脈,固定線栓,90 min后拔出線栓,最后縫合切開皮膚[10]。I/R手術(shù)成功率約為70%。假手術(shù)組和模型對照組大鼠手術(shù)步驟一樣,只是不插線栓。小鼠MCAO手術(shù)90 min后分別灌服不同劑量(10,25,50和100 mg·kg-1)朝鮮當(dāng)歸提取物(0.9%氯化鈉溶液溶解),再灌注24 h后麻醉處死,進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3.3腦梗死體積測定 再灌注24 h后,迅速將動物斷頭取腦,將腦組織置于冰箱-20 ℃冷凍10~15 min,自前腦額極起用鋒利刀片切成冠狀切片,每片厚約1.5 mm,將腦片置于0.5%TTC染色液中,于37 ℃下孵育30 min。腦片用掃描儀掃描,用image pro plus 軟件對腦片梗死體積進(jìn)行分析[11]。

1.3.4Western blotting分析 再灌注24 h后,通過試劑盒提取小鼠半影區(qū)總蛋白,取20 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分析,電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。然后分別加入兔抗Ang-1、VEGF、ZO-1和Occludin多克隆抗體(1:1000)和鼠抗……-actin多克隆抗體(1:5000)孵育。再加入山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1:5000),室溫孵育。最后用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測,應(yīng)用Quantity one軟件對吸光度進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1朝鮮當(dāng)歸提取物對I/R小鼠腦梗死體積影響 采用TTC染色觀察I/R小鼠腦梗死體積變化。模型對照組相對腦梗死體積為(29.7±5.2)%。10,25,50和100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸組小鼠相對腦梗死體積分別為(31.1±5.6)%,(24.0±3.9)%,(18.5±5.8)% 和(15.8±3.7)%(圖1)。與模型對照組比較,50和100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸提取物可以顯著減小腦梗死體積(F=13.84,P<0.01)。

圖1 5組小鼠腦梗死情況(典型TTC 染色圖)

Fig.1Cerebralinfarctioninfivegroupsofmice(representativeimagesofTTCstaining)

2.2朝鮮當(dāng)歸提取物對I/R小鼠血管生成調(diào)節(jié)蛋白影響 如圖2所示,與假手術(shù)組比較,模型對照組Ang-1表達(dá)顯著降低(F=19.21,P<0.01)。與模型對照組比較,25,50 和 100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸提取物處理后Ang-1(F=19.21,P<0.01)和VEGF(F=22.63,P<0.01)表達(dá)明顯增加。此外,與模型對照組比較,100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸處理后p-Akt(F=15.07,P<0.01)和PI3K(F=17.52,P<0.01)表達(dá)明顯增高(圖3)。如圖4所示,與假手術(shù)組比較,模型對照組ZO-1(F=12.74,P<0.01)和Occludin(F=16.16,P<0.01)表達(dá)顯著降低;朝鮮當(dāng)歸治療后ZO-1表達(dá)明顯增高,呈劑量依賴性(F=17.89,P<0.01)。

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組;D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組;E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組;F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組;①與假手術(shù)組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01。

圖2 6組小鼠Ang-1和VEGF表達(dá)比較

A.sham operation group;B.model control group;C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group;D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group;E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group;F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01;②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.2 Comparison of the expression of Ang-1 and VEGF among six groups of mice

2.3朝鮮當(dāng)歸提取物對I/R小鼠血-腦屏障通透性影響 如圖5所示,伊文思蘭染色顯示,與假手術(shù)組比較,模型對照組血-腦屏障通透性增大(F=48.62,P<0.01);25,50 和 100 mg·kg-1組血-腦屏障通透性顯著降低(F=48.62,P<0.01)。

3 討論

本研究顯示,朝鮮當(dāng)歸對I/R小鼠神經(jīng)具有保護(hù)作用。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活,使傷口愈合,并在腦損傷修復(fù)中促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[12]。局灶性腦缺血中檢測到Ang-1和 Ang-2表達(dá),Ang-1具有保護(hù)血管通透性作用,還可以激活Tie-2受體,發(fā)揮抗炎作用[13]。PI3K/Akt通路激活Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使血管血管通透性保持穩(wěn)定;血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF和Ang-1不能直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長,但是通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長[14]。與VEGF不同,Ang-1主要在血管發(fā)育階段發(fā)揮作用,例如血管重塑和成熟。本研究中,朝鮮當(dāng)歸提取物可增加I/R小鼠缺血半影區(qū)VEGF和 Ang1表達(dá)。刺激小鼠腦VEGF和Ang-1 表達(dá)可增加微血管密度,大劑量VEGF和Ang-1聯(lián)合使用促進(jìn)缺血狀態(tài)下血管形成[15]。本研究表明,朝鮮當(dāng)歸促進(jìn)缺血性腦損傷后血管生成,主要是通過增加VEGF和Ang1的表達(dá)。

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組;D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組;E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組;F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組;①與假手術(shù)組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.05;③與模型對照組比較,P<0.01。

圖3 6組小鼠Akt和PI3K表達(dá)比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group; ①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.05;③Compared with model control group,P<0.01.

Fig.3ComparisonoftheexpressionofAktandPI3Kamongsixgroupsofmice

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組;D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組;E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組;F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組;①與假手術(shù)組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01。

圖4 6組小鼠ZO-1和Occludin表達(dá)比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.4ComparisonoftheexpressionofZO-1andOccludinamongsixgroupsofmice

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組;D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組;E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組;F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組;①與假手術(shù)組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01。

圖5 6組小鼠血-腦屏障通透性比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.5Comparisonofblood-brainbarrieramongsixgroupsofmice

血-腦屏障是一個高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如卒中、癲、阿爾茨海默病和腦腫瘤與血-腦屏障功能障礙有關(guān)[16]。此外,血-腦屏障損傷有助于繼發(fā)性炎癥和神經(jīng)元損傷,從而促使疾病發(fā)展。在本研究中,朝鮮當(dāng)歸提取物處理減少I/R小鼠血-腦屏障破壞。緊密連接蛋白是血-腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞之間一種有效的屏障。在生理和病理條件下,緊密連接蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位、翻譯后調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用會發(fā)生變化[17]。朝鮮當(dāng)歸提取物促進(jìn)缺血腦組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá),呈劑量依賴性關(guān)系。因而朝鮮當(dāng)歸提取物可以有效預(yù)防I/R小鼠血-腦屏障損傷引起的神經(jīng)元損傷。此外,朝鮮當(dāng)歸主要含有紫花前胡素、紫花前胡醇當(dāng)歸酯、7-去甲基軟木花椒素、異紫花前胡內(nèi)酯和紫花前胡醇,均為香豆素類化合物,可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-1和環(huán)氧化酶-2等[18]。由于朝鮮當(dāng)歸具有抗炎作用,也可能在緩解I/R小鼠血-腦屏障損傷引起的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮作用。

總之,朝鮮當(dāng)歸可激活PI3K/Akt通路,增加血管生成誘導(dǎo)蛋白Ang-1、VEGF 和緊密連接蛋白ZO-1和 Occludin表達(dá),因而具有減小I/R引起的腦梗死體積及血-腦屏障通透性等作用。

猜你喜歡
通透性屏障提取物
咬緊百日攻堅 筑牢安全屏障
蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
中藥提取物或可用于治療肥胖
屏障修護(hù)TOP10
植物提取物:你意想不到的辣椒
一道屏障
維護(hù)網(wǎng)絡(luò)安全 筑牢網(wǎng)絡(luò)強省屏障
紫地榆提取物的止血作用
PICCO監(jiān)護(hù)儀觀察ARDS肺血管內(nèi)皮通透性的臨床研究
盆栽與大田栽培水稻的生長及產(chǎn)量的比較研究