陳玉樂，楊文杰，呂 偉，劉天杰，李 磊

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

膀胱癌是人體泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一[1]。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)是降鈣素基因肽超家族成員，參與了心血管疾病、炎癥和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。受體活性調(diào)節(jié)蛋白(receptor activity modifying protein，RAMP)2和RAMP3在AM與其受體的結(jié)合中具有決定性的調(diào)控作用，是AM介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)及生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[2]。體外研究表明，AM可抑制膀胱癌細胞凋亡，并促進膀胱癌細胞生長、侵襲及遷移[3-4]。然而，AM及其下游信號關(guān)鍵蛋白在膀胱癌組織中的表達尚不明確。在本研究中，我們擬通過免疫組織化學(xué)染色方法探討AM、RAMP2、RAMP3在膀胱癌中的表達和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料AM和RAMP3抗體購自Abcam公司(Cambridge，UK)。RAMP2抗體購自Santa Cruz 公司(CA，USA)。EnVision免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自DAKO 公司(CA，USA)。

1.2 膀胱癌組織標本人膀胱癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司(貨號：HBla-Uro105Sur-01)，包含59例膀胱移行細胞癌和46例癌旁尿路上皮組織。3張組織芯片分別用于AM、RAMP2、RAMP3的免疫組織化學(xué)染色。無尿路上皮組織或癌組織、染色過程中脫片或因有效組織太小影響結(jié)果判定者均被排除。11例標本因缺乏患者生存信息而被排除于生存分析之外。最終25例尿路上皮組織和58例膀胱癌組織被用于蛋白表達分析，47例膀胱癌組織被用于生存分析。本研究所采用的膀胱癌標本的臨床和病理信息見表1。

表1 58例膀胱癌臨床病理資料

項目例數(shù)(%)中位年齡(歲)68.4(44～85)臨床分期 Tis5(5.9) T111(19.0) T217(29.3) T322(37.9) T43(5.2)項目例數(shù)(%)性別 男49(84.5) 女9(15.5)病理分級 G13(5.2) G232(55.2) G323(39.7)中位隨訪時間(月)34.1(3～82)

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果評估采用DAKO EnVisionTM +系統(tǒng)進行免疫組織化學(xué)染色。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化等處理后浸入檸檬酸緩沖液，于121 ℃抗原修復(fù)5 min。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷15 min后滴加一抗(1∶150稀釋)，4 ℃孵育12 h，隨后用EnVision-HRP標記的二抗室溫孵育30 min，并依次進行DAB顯色、蘇木素染色、鹽酸分化、氨水返藍等處理。梯度酒精溶液脫水和二甲苯透明后以中性樹膠封片。染色結(jié)果評估按本實驗室常用的綜合染色強度與陽性細胞百分比的雙重評分系統(tǒng)進行。由1位病理科醫(yī)師在不知實驗?zāi)康呐c患者信息的情況下進行，每例組織在高倍鏡下隨機挑取5個高倍視野進行評分。根據(jù)染色強度將結(jié)果分為無著色、弱著色、中等著色及強著色4類，分別得0、1、2、3分；根據(jù)陽性細胞百分比將結(jié)果分為-、<25%、25%～≤50%、>50%～≤75%、>75%共5類，分別得0、1、2、3、4分。將上述2種方法得分相乘得到介于0～12分之間的總得分，將總得分≥4分的組織定義為表達陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Pearson卡方檢驗(T>5)或Yates’連續(xù)性校正卡方檢驗(T≤5)進行不同組別間蛋白表達差異分析，采用log-rank檢驗進行生存分析。P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AM在膀胱癌組織中的表達通過對25例癌旁尿路上皮組織和58例膀胱移行細胞癌組織的免疫組織化學(xué)染色，觀察到AM主要定位于尿路上皮細胞和膀胱癌細胞的細胞質(zhì)中(圖1A，紅色箭頭)。根據(jù)我們的評分標準，11例(44%)尿路上皮組織和23例(39.6%)膀胱癌組織被鑒定為AM陽性。統(tǒng)計分析顯示癌旁尿路上皮組織和膀胱癌組之間無顯著差異(P>0.05)。AM表達與患者年齡、性別、腫瘤分期、分級無關(guān)(表2)。生存分析顯示AM+組和AM-組患者總生存期無明顯差異(HR:0.68，95%CI:0.32～1.47，P=0.34，圖1B)。此外，間質(zhì)細胞中也有AM表達(圖1A，藍色箭頭)，表明間質(zhì)細胞也是腫瘤微環(huán)境中AM的重要來源。

圖1 AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達

A：AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達(紅色、藍色箭頭分別示腫瘤和間質(zhì)細胞中的AM表達)；B：AM+和AM-組患者總生存期比較。

2.2 RAMP2在膀胱癌組織中的表達隨后我們進行了RAMP2的免疫組織化學(xué)染色(圖2A)。7例(28%)尿路上皮組織和32例(55.2%)膀胱癌組織被鑒定為RAMP2陽性。統(tǒng)計分析表明，兩組間RAMP2表達具有顯著性差異(P<0.05)。通過對不同分級腫瘤的比較發(fā)現(xiàn)，3級膀胱癌具有比1～2級膀胱癌更高的RAMP2表達水平的趨勢(60.9%vs.51.4%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2，P>0.05)。此外，年齡<70歲的患者的RAMP2表達水平高于≥70歲的患者(表2，P<0.05)。不同性別、腫瘤分期患者RAMP2表達無明顯差異(表2)。與RAMP2-的患者相比，RAMP2+的患者具有更短的總生存期(HR:2.73；95%CI:1.30～5.80；P<0.01，圖2B)。

2.3 RAMP3在膀胱癌組織中的表達針對RAMP3的免疫組織化學(xué)染色(圖2A)發(fā)現(xiàn)，19例(76%)尿路上皮組織和48例(82.8%)膀胱癌組織被鑒定為RAPM3陽性。統(tǒng)計分析表明癌旁尿路上皮組織與膀胱癌組之間RAMP3表達無顯著差異(P>0.05)。RAMP3表達與患者年齡、性別及腫瘤分期、分級無關(guān)(表2)。此外，RAMP3-患者與RAMP3+患者的總生存期也無明顯差異(HR:1.36；95%CI:0.51～3.45；P>0.05，圖2C)。

圖2 RAMPs在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達

A:RAMP2和RAMP3的表達代表圖；B:RAMP2+和RAMP2-組患者總生存期比較；C.RAMP3+和RAMP3-組患者總生存期比較。

表2 AM、RAMP2和RAMP3在膀胱癌的表達與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

3 討 論

AM是一種具有舒張血管、降低血壓等多重活性的分泌性蛋白，因最初是從人腎上腺嗜鉻細胞瘤中分離出來而得名[5]。腫瘤微環(huán)境中AM的來源及調(diào)控復(fù)雜多變。一方面，腫瘤細胞在發(fā)生發(fā)展過程中可獲得較高的AM表達水平[6]；另一方面，多種間質(zhì)細胞成分如血管內(nèi)皮細胞、肥大細胞、巨噬細胞和成纖維細胞等均可產(chǎn)生AM[7]。此外，缺氧等條件也進一步誘導(dǎo)腫瘤細胞表達AM[8]。AM介導(dǎo)的bcl-2上調(diào)對于缺氧條件下骨肉瘤細胞的存活至關(guān)重要[9]。我們最近的研究表明，腎癌細胞產(chǎn)生的AM可通過肥大細胞促進血管形成[10]。有學(xué)者通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot實驗初步檢測了AM在人膀胱癌及癌旁正常組織的表達水平，發(fā)現(xiàn)AM在膀胱癌的表達高于癌旁組織，并與腫瘤分期正相關(guān)。在體外培養(yǎng)的膀胱癌細胞系，AM可被缺氧條件誘導(dǎo)表達，沉默AM表達可促進細胞凋亡并抑制腫瘤生長[4]。另一項研究表明，AM可促進膀胱癌和前列腺癌細胞的侵襲和遷移[3]。本研究中，我們通過免疫組織化學(xué)染色檢測了AM在膀胱癌及癌旁尿路上皮組織的表達，相對于實時定量聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot，免疫組織化學(xué)染色可更直觀地檢測蛋白在組織及細胞的定位情況。與前人研究不同的是，我們并未發(fā)現(xiàn)AM在膀胱癌和尿路上皮組織之間的表達差異，亦未觀察到AM與腫瘤分期有關(guān)。我們在膀胱癌細胞及膀胱癌間質(zhì)細胞中均觀察到AM表達，表明膀胱癌組織中AM來源的復(fù)雜性，也提示AM可能是膀胱癌細胞和間質(zhì)細胞之間“對話”的重要介質(zhì)。

降鈣素受體樣受體(calcitonin-receptor-like receptor，CRLR)隸屬G蛋白偶聯(lián)受體，是AM的主要受體[7]。CRLR與AM的結(jié)合受RAMPs調(diào)控。當CRLR與RAMP1結(jié)合時，形成降鈣素受體而與降鈣素結(jié)合。當CRLR與RAMP2或RAMP3結(jié)合時，形成AM受體，與AM結(jié)合并介導(dǎo)其生物學(xué)功能。因此，RAMPs可決定AM與CRLR的親和力，是AM下游信號的重要調(diào)節(jié)蛋白[2]。研究表明，AM可通過CRLR/RAMP2、CRLR/RAMP3實現(xiàn)對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、分化和凋亡的調(diào)控。

然而，RAMP2與RAMP3的功能并不完全相同。CRLR/RAMP2只能被AM激活，而CRLR/RAMP3對AM和intermedin(也稱為AM2)具有相同的親和力，因而可以被這兩種配體激活[2]。動物實驗顯示AM或RAMP2敲除小鼠由于血管異常而在子宮內(nèi)死亡，但RAMP3敲除小鼠正常出生，且未被發(fā)現(xiàn)明顯異常，表明CRLR/RAMP2和CRLR/RAMP3具有不同的功能[5]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與尿路上皮組織相比，RAMP2在膀胱癌組織中上調(diào)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。然而，尿路上皮組織和膀胱癌組織都具有較強的RAMP3表達，且膀胱癌中的RAMP3表達對患者的存活無明顯影響。由于RAMP2與CRLR形成特異性AM受體，因此我們推測RAMP2可能是膀胱癌中AM信號的下游關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。

綜上所述，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)AM廣泛表達于膀胱癌細胞及膀胱癌間質(zhì)細胞，表明腫瘤細胞和間質(zhì)細胞均是膀胱癌微環(huán)境中AM的來源。RAMP2在膀胱癌組織高表達并與患者不良預(yù)后有關(guān)，提示RAMP2是膀胱癌中AM信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，并可能參與了膀胱癌進展。后續(xù)研究將進一步通過體外實驗和動物模型等來明確AM/CRLR/RAMP2信號在膀胱癌進展中的詳細作用及分子機制。