賈紅磊，劉華欣，馬佩云，王 肖

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

Cd是一種對植物生長有毒害作用的重金屬，因其易被植物吸收，在植物體內(nèi)移動性極強，對植物生長發(fā)育危害極大[1]，植物組織內(nèi)Cd累積會造成體內(nèi)大量的活性氧產(chǎn)生，影響植物對Ca2+、Mg2+等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制葉綠素的產(chǎn)生及葉綠體內(nèi)的電子傳遞[2-4].Cd通過損傷植物細胞分裂，破壞酶活結(jié)構(gòu)等方式直接或間接來抑制植物生理過程，最終抑制植物生長或?qū)е轮参锼劳鯷5].

H2S是繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子，H2S的作用在動物體內(nèi)的各種生理功能及在治療各心血管疾病與高血壓等疾病上的重大功效均已有較大進展[6,7].目前，在H2S調(diào)節(jié)植物的生理功能及生長發(fā)育方面的研究逐漸深入.研究表明，H2S不僅參與植物生理生長調(diào)控，如通過調(diào)節(jié)植物氣孔運動，增強植物光合作用等來促進植物生長[8,9]，也可提高植物對抗逆境脅迫的適應(yīng)性，如H2S可緩解重金屬脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫、活性氧脅迫、非生物脅迫等[10-14].Bharwana等研究發(fā)現(xiàn)H2S可提高棉花株高、葉面積、葉綠素含量并降低棉花組織中Pb的含量，以此來緩解Pb脅迫對棉花造成的傷害[15].由此可見，H2S可緩解植物因各種生物脅迫、非生物脅迫造成的損害，但因H2S在植物體內(nèi)的具體作用機制的研究尚不明確，有報道鹽脅迫會影響菘藍幼苗生長生理，會影響菘藍幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)酶活性，進而對菘藍幼苗造成傷害[16,17].而在重金屬脅迫下H2S對菘藍幼苗緩解作用的研究較少.

本研究以菘藍幼苗為研究對象，用NaHS作為H2S的外源供體，在水培條件下探究H2S緩解Cd脅迫的最適濃度，并在最適H2S緩解濃度下，以不同的Cd濃度加以驗證.探究Cd脅迫下外源H2S對菘藍幼苗生長生理的影響，分析H2S在緩解提高菘藍幼苗對Cd脅迫抗性的作用，為菘藍幼苗應(yīng)對Cd脅迫提供理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料及培養(yǎng)

菘藍種子購于安國市萬草同源苗木花卉有限公司，挑選飽滿種子于37 ℃溫水中浸泡0.5～1 h后，均勻置于裝有蛭石的穴盤中，待有真葉長出時，將其移至含有1/4 Hoagland營養(yǎng)液的水培箱中進行培養(yǎng).培養(yǎng)條件為光照16 h，黑暗8 h，相對濕度40%～60%，溫度為26±2 ℃(晝)，20±2 ℃(夜).

1.2 實驗方法

1.2.1 Cd脅迫下不同濃度硫化氫對菘藍幼苗指標的測定

(1)幼苗株高的測定

待菘藍幼苗在含有1/4 Hoagland營養(yǎng)液的水培箱中長至四片真葉時，挑選長勢一致的壯苗分別移至含有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的水培處理罐中處理7天，對幼苗進行成像，并用 Image-J測量幼苗植株長度[18].設(shè)置十組處理，分別為空白處理罐，含有(50μmol·L-1NaHS、100μmol·L-1NaHS、150μmol·L-1NaHS、200μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2、5 mg·L-1CdCl2+50μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+100μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+200μmol·L-1NaHS)的水培處理罐.

(2)幼苗不同部位Cd含量測定

將長至四片真葉、挑選長勢一致的菘藍幼苗分別移至含有1/2 Hoagland營養(yǎng)液不同處理的水培處理罐中處理7天，處理同1.2.1(1).收集菘藍幼苗根分別用0.5 mmol·L-1的EDTA-Na2浸泡15 min，將處理后收集菘藍幼苗的地上部分、地下部分，105 ℃殺青后，80 ℃烘干至恒重.稱0.1 g干樣置于消解管中，80 ℃消解1.5 h，120 ℃消解1.5 h，150 ℃消解3 h，而后在175 ℃下加酸溶解，將液體轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用1% HNO3定容，定容后溶液用0.45μm濾膜過濾備用，用原子吸收光譜儀(AAS)進行Cd含量測定.

1.2.2 Cd脅迫下不同濃度硫化氫對菘藍幼苗指標的測定

(1)幼苗株高的測定

測定方法同1.2.1(1)中植株高度測定，在含有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的水培處理罐中處理七天.設(shè)置八組處理，分別為空白處理罐，含有(150μmol·L-1NaHS、1.0 mg·L-1CdCl2、2.5 mg·L-1CdCl2、5.0 mg·L-1CdCl2、1.0 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、2.5 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、5.0 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS)的水培處理罐.

(2)幼苗不同部位Cd含量測定

處理方法同1.2.2(1).測定方法同1.2.1(2)中Cd含量測定.

(3)幼苗葉綠素含量測定

處理方法同1.2.2(1).測定方法采取95%乙醇提取法，帶提取液制備完成后，在波長665 nm、649 nm、470 nm下，以95%乙醇為空白，測定葉綠體色素提取液的吸光度.

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Origin 9.1、Image J及SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析和顯著性分析.所有實驗數(shù)據(jù)均為三次實驗均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd脅迫下不同濃度H2S對菘藍幼苗的影響

2.1.1 對菘藍幼苗株高的影響

重金屬Cd對植物生長發(fā)育的影響主要表現(xiàn)在植株矮小、生長緩慢、生物量下降等，主要由于Cd影響植物進行光合作用過程中所必需的葉綠素脂還原酶的活性，從而導(dǎo)致葉綠素含量的降低[19].H2S作為氣體信號分子，H2S參與植物種子萌發(fā)及生長發(fā)育和過程[20].高濃度的Cd會影響芝麻及芥菜型油菜根系生長及幼苗的生長[21,22].

在本實驗條件下，菘藍幼苗的植株高度如圖1 所示.5 mg·L-1的Cd處理與對照組相比，植株高度降低26.60%，說明5 mg·L-1濃度的Cd會明顯抑制菘藍幼苗的生長，此濃度下加入不同濃度的NaHS發(fā)現(xiàn)，150μmol·L-1和200μmol·L-1NaHS處理組下菘藍幼苗較Cd對照組相比植株高度有顯著性上升，分別增加了14.44%、14.41%，說明外源H2S在一定程度上可以緩解由于Cd脅迫導(dǎo)致的菘藍幼苗植株生長抑制.

2.1.2 對菘藍幼苗體內(nèi)Cd分布的影響

硫化氫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生螯合肽(phytochelatin PC)、金屬硫蛋白(metallothinein MT)降低重金屬離子的轉(zhuǎn)運效率[23].如圖2所示，不同濃度的NaHS對Cd在菘藍幼苗根部的富集具有促進作用，與加入5 mg·L-1的Cd處理相比較，外源添加50μmol·L-1NaHS、100μmol·L-1NaHS、150μmol·L-1NaHS、200μmol·L-1NaHS各處理組地下部分中Cd含量增加42.97%、77.29%、187.54%、137.44%；地上部分中Cd含量分別降低1.87%、27.35%、44.26%、29.48%.可以看出，當(dāng)NaHS濃度為150μmol·L-1時.大部分Cd被富集在菘藍幼苗的根部，同時菘藍幼苗地上部分中Cd含量最低.說明外源H2S可通過將Cd富集在菘藍幼苗的根部以減少Cd向上的運輸，此時轉(zhuǎn)運系數(shù)降至最低為0.078 26，如圖3所示.因此，選定150μmol·L-1NaHS繼續(xù)后續(xù)實驗.

(a)Cd脅迫下不同濃度H2S對菘藍幼苗地上部分中Cd含量

(b)Cd脅迫下不同濃度H2S對菘藍幼苗地下部分中Cd含量圖2 Cd脅迫下不同濃度H2S對菘藍幼苗地上、地下部分中Cd含量

圖3 Cd脅迫下不同濃度H2S對菘藍幼苗體內(nèi)Cd的轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

2.2 不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗生長的影響

2.2.1 對菘藍幼苗株高的影響

當(dāng)外源H2S供體NaHS的最佳濃度確定為150μmol·L-1后，本實驗設(shè)置了對照組、不同濃度的Cd脅迫處理組及加入NaHS的緩解處理組.如圖4 所示，與對照組相比，不同濃度Cd處理后，菘藍幼苗株高分別降低了22.07%、33.56%、31.33%，加入NaHS后，株高較各組Cd對照組相比分別升高了8.47%、12.49%、5.08%.這與2.1中實驗結(jié)果相一致，棉花在Pb脅迫下，外源添加NaHS會緩解因Pb對棉花幼苗造成的株高、葉面積、生物量下降的脅迫[15].說明添加H2S供體NaHS可以緩解菘藍幼苗因Cd脅迫造成的損傷.

圖4不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗株高的影響

2.2.2 對菘藍幼苗葉綠素的影響

重金屬脅迫會誘導(dǎo)植物體內(nèi)超氧自由基(ROS)爆發(fā)，超氧自由基能夠直接或間接導(dǎo)致細胞質(zhì)膜的過氧化作用，進而導(dǎo)致細胞膜的損傷[3]；超氧自由基也可能會抑制了光合葉綠素所需葉綠素酸酯還原酶的活性[19]，從而導(dǎo)致葉綠素含量下降及葉綠素a+b值的降低.有研究表明Cd會降低芝麻、決明子及棉花中葉綠素的含量及葉綠素a+b值[3,15,21].

如圖5所示，不同濃度Cd處理后，與對照組相比均顯著性下降，葉綠素a含量分別降低了38.28%、32.17%、12.08%；葉綠素b含量分別降低了22.42%、28.3%、1.17%；，類胡蘿卜素含量分別降低了53.75%、42.45%、58.02%，在添加H2S外援供體NaHS后，1.0 mol·L-1CdCl2、1.5 mol·L-1CdCl2處理組與其各自Cd對照組相比葉綠素a含量分別升高了45.42%、24.14%；葉綠素b含量分別升高了53.09%、34.17%；類胡蘿卜素含量分別升高了38.86%、36.51%.而加入NaHS的5.0 mg·L-1CdCl2的處理組葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別降低了38.14%、8.64%、54.31%.H2S為氣體信號分子，在低濃度下有促進植物生長發(fā)育的作用，當(dāng)Cd濃度達到5.0 mol·L-1時，植物生長狀態(tài)較差，Cd引起菘藍幼苗生長異常，導(dǎo)致幼苗對H2S更加敏感，此時H2S可能表現(xiàn)出對菘藍幼苗的毒性作用，而并非緩解Cd脅迫的作用.

(a)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗葉綠素a含量的影響

(b)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗葉綠素b含量的影響

(c)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗類胡蘿卜素含量的影響

(d)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗葉綠素a+b含量的影響圖5 不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗葉綠素含量的影響

2.2.3 對菘藍幼苗不同部位Cd的影響

有研究表明，H2S能顯著降低棉花幼苗根、莖、葉中Pb的含量[15].在本實驗中，如圖6 所示，外源添加NaHS后，菘藍幼苗地下部分較各自Cd脅迫對照組分別增加了34.40%、34.60%、41.76%，地上部分較各自Cd脅迫對照組分別減少了52.84%、46.69%、43.23%.

(a)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗地上部分中Cd含量的影響

(b)不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗地下部分中Cd含量的影響圖6 不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗中Cd含量的影響

如圖7所示，外源添加NaHS后，菘藍幼苗體內(nèi)Cd的轉(zhuǎn)運系數(shù)均顯著性降低，說明H2S通過將Cd富集在菘藍幼苗的根部，減少地上部分中Cd的積累來緩解Cd對菘藍幼苗造成的脅迫.

圖7 不同濃度Cd脅迫下H2S對菘藍幼苗體內(nèi)Cd的轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

3 結(jié)論