徐菲菲，徐海笑，梁蓉，鐘芳

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

近年來，隨著消費者對食品健康與安全關(guān)注日益增加，天然色素的市場需求日益增長，其開發(fā)和利用具有較大的商業(yè)價值。根據(jù)色素的色調(diào)，紅曲色素分為紅曲紅、紅曲黃和紅曲橙3類；其中公認(rèn)的黃色素2種組分為紅曲素和安卡紅曲黃素[1]。目前紅曲紅色素已大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，它具有一系列有利于健康的生理活性[2-7,8-10]。在固態(tài)紅曲米色素中，3類色素共存，含有一定含量的黃色素，種類較多、成分復(fù)雜，直接以溶劑提取法從紅曲色素產(chǎn)品中分離提取利用并不經(jīng)濟(jì)，因而相關(guān)的研究主要集中在高色價的紅曲菌篩選和固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化上。

毛鵬[11]篩選出黃色素產(chǎn)量高的紅曲菌Monascussp.sjs-6，并優(yōu)化發(fā)酵條件，最終發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黃色素色價達(dá)到397.2 U/mL。薄層析色譜對色素進(jìn)行展開，出現(xiàn)一個深黃色和一個淺黃色色帶，特征吸收波長分別為421和409 nm，且色素不含有橙色素和紅色素。但研究并未對這2種色素條帶進(jìn)行進(jìn)一步的純化鑒定，其所含色素的分子結(jié)構(gòu)式尚未明確。根據(jù)文獻(xiàn)報道目前已發(fā)現(xiàn)35種紅曲黃色素組分[12]，因而需要分離純化出高純度紅曲黃色素組分并鑒定其分子結(jié)構(gòu)。

MARIE等[13]采用連續(xù)薄層析色譜法分離紅曲黃色素，先用氯仿-丙酮(9∶1，體積比)作為展開劑，然后用石油醚-二乙基醚(5∶5，體積比)再次展開，從MonascusruberATCC 96218的發(fā)酵產(chǎn)物中得到黃色斑點，進(jìn)一步使用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化，得到高純度組分，經(jīng)核磁共振分析確定為Monarubrin和Rubropunctin。楊強等[14]采用硅膠柱層析法，分離純化了紅曲菌絲體內(nèi)醇溶性紅曲黃色素，經(jīng)鑒定表征，確定3種色素組分為紅斑胺素、紅曲素、紅斑素，其中紅曲素為主要成分。夏明等[15]采用高速逆流色譜法，從紅曲米中提取的色素中分離出一種黃色素和一種紫紅色素，但并未對2種組分進(jìn)行進(jìn)一步分析。鄭允權(quán)等[16]建立兩步逆流萃取，通過高速逆流色譜法從紅曲粉中分離得到紅、橙、黃6種色素組分，純度均大于98.5%。崔莉等[17]從紅曲米中索氏抽提出紅曲黃色素粗提取物，并用制備液相分離純化得到高純度的紅曲素和安卡紅曲黃素，建立了高效液相色譜同時檢測紅曲混合色素中紅曲黃色素含量的檢測方法，具有較高的重復(fù)性和精密度。

本研究以通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的高色價紅曲黃色素為研究對象，采用高效液相色譜作為分離手段，分離純化并制備少量高純度的紅曲黃色素組分，使用液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析對色素組分的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以鑒定液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素的主要色素成分，為紅曲黃色素在食品工業(yè)中應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 實驗材料

液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素粗提物，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院毛鵬所在實驗室提供；無水乙醇、液相色譜級甲醇、液相色譜級甲酸、氘代氯仿，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，市售。

1.2 實驗設(shè)備

A560分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；E2695高效液相色譜儀、1525半制備型液相色譜儀、MALDI SYNAPT MS液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司；DZG-6050SAD真空干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；Aduance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀，德國布魯克AXS有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲黃色素的萃取

將體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液與含色素的脂溶性提取物按體積比4∶1混勻，靜置分層，取上層乙醇溶液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，除去乙醇和水，獲得天然紅曲黃色素油樹脂(色素和油脂類物質(zhì)的互溶物)。

1.3.2 紅曲黃色素色價的測定

精確稱取一定量紅曲黃色素油樹脂，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻。取樣品溶液置于1 cm比色皿中，以無水乙醇為空白對照，用分光光度計在350～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，于波長(410±10)nm的最大吸收波長處測定其吸光度。色價(U/g)按公式(1)計算:

色價=吸光度(A)×稀釋倍數(shù)

(1)

1.3.3 分析型高效液相色譜分離紅曲黃色素組分

稱取0.15 g紅曲黃色素油樹脂，用無水乙醇溶解并定容至250 mL。將溶液以0.22 μm有機膜過濾后進(jìn)樣。流動相A：100%甲醇，流動相B：100%水；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL，樣品室溫度：20 ℃；柱溫：30 ℃；波長掃描范圍：220～600 nm；色譜柱：Symmetry C18反相硅膠柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。分離度R按公式(2)計算：

(2)

式中，tR2,相鄰兩峰后一峰的保留時間；tR1,相鄰兩峰前一峰的保留時間；W1、W2,相鄰兩峰的峰寬。

1.3.4 制備型液相色譜分離紅曲黃色素組分

稱取一定量的紅曲黃色素油狀樹脂，用甲醇溶解，制得0.1 g/mL的色素甲醇溶液，以0.22 μm有機膜過濾。將分析型液相色譜的分離條件乘以放大系數(shù)4.73后作為制備液相的初始條件，再根據(jù)實際的分離情況對分離條件進(jìn)行優(yōu)化。對收集到的目標(biāo)組分在分析型液相色譜上進(jìn)行分析，以峰面積歸一化法計算純度。色譜柱為X bridge C18反相硅膠柱(10 mm×250 mm，5 μm)。流出液在40 ℃進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集液至稱量瓶中；吹N2除去甲醇后置于真空干燥箱，30 ℃下真空干燥72 h，獲得高純度色素組分。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

紅曲黃色素組分用色譜級甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機膜過濾后進(jìn)樣。色譜柱：Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A：100%甲醇；流動相B：水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)；流速：0.3 mL/min：分析時間：15 min。洗脫程序：0～0.1 min，5%甲醇等度洗脫；0.1～8 min，5%甲醇線性變化至80%甲醇；8～10 min，80%甲醇線性變化至100%甲醇；10～12 min 100%甲醇等度洗脫；12～12.1 min 100%甲醇線性變化至5%甲醇。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：ESI源，ESI+毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流：700 L/h；錐孔氣流：50 L/h；碰撞能量：6 eV；掃描質(zhì)量(m/z)范圍：50～1 000；檢測器電壓：1 800 V。

1.3.6 核磁共振分析

以氘代氯仿為溶劑，樣品質(zhì)量濃度：30 mg/mL，測試溫度：25 ℃，氫譜(1H NMR)的觀測頻率：400.140 MHz，碳譜(13CNMR)的觀測頻率：100.625 MHz。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

核磁共振分析軟件為TopSpin 4.0.1，質(zhì)譜分析軟件為MassLynx V4.1。所得數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.0軟件制圖，其中二維核磁共振數(shù)據(jù)采用MestReNova制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲黃色素的萃取

紅曲發(fā)酵液的黃色素粗提物油相的色價為(701±42.7) U/g，所得油樹脂的色價為(9 100±93.1)U/g，萃取率為63.50%，與李明起[18]采用溶劑抽提法提取紅曲色素的得率66%較為接近。

2.2 分析型液相色譜分離條件的優(yōu)化

以甲醇-水為流動相，流速為0.5 mL/min，并通過改變流動相的極性，探究紅曲黃色素中不同組分的保留時間、出峰形狀和相鄰峰干擾狀況，優(yōu)化分離條件使紅曲黃色素組分之間完全分離，即分離度R大于1.5[19-20]。

由表1可知，在90%甲醇等度洗脫的情況下，紅曲黃色素在330～440 nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)2個相鄰的大峰，峰A和峰B。330～440 nm為黃色素的特征吸收峰[21]，峰A和峰B的對應(yīng)物質(zhì)為紅曲黃色素的主要組分。其中，峰A的最大吸收波長為235和394 nm，峰B的最大吸收波長為235和389 nm。此條件下2個相鄰峰的分離度為0.95，表明2個峰沒有完全分開。將流動相調(diào)整為85%甲醇時，兩峰之間的分離度為1.63，表明二者完全分離，但存在雜質(zhì)峰與兩峰部分重疊。進(jìn)一步將流動相調(diào)整為80%甲醇時，2個峰的分離度進(jìn)一步增加至2.51，且無雜質(zhì)峰干擾(圖1)。但當(dāng)流動相進(jìn)一步調(diào)整至75%甲醇時，兩峰的保留時間變長，分別達(dá)到19.8 min和22.1 min，分離度因峰變寬而減小，為2.21。綜合考慮分離效果和分離時間，確定最佳洗脫條件為80%的甲醇等度洗脫。

2.3 制備型液相色譜分離純化制備高純度紅曲黃色素組分

根據(jù)色素組分分離狀況和分離時間調(diào)整流動相的極性和流速，確定洗脫條件為：流速4 mL/min，70%甲醇等度洗脫。組分A和組分B的保留時間分別為18.7和20.5 min，分離度為2.12，滿足分離要求(圖2)。收集半峰高以上的流出液以確保色素組分較高的純度。

收集得到的組分A和組分B的流出液在分析型液相上進(jìn)行純度檢測。經(jīng)檢測，制備液相純化得到的組分A和組分B的純度分別為98.95%和99.02%，已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品純度(純度大于97%)。

2.4 質(zhì)譜分析

對制備型液相色譜分離得到的高純度色素組分A和組分B進(jìn)行質(zhì)譜分析(見圖3)。

由圖3可知，組分A在質(zhì)譜上的離子峰為359，故組分A的相對分子質(zhì)量為358。此相對分子質(zhì)量與BUSABA等[22-23]報道的紅曲素和Monankins A、Monankins B和Monakins F的相對分子質(zhì)量一致，組分B在質(zhì)譜上的離子峰為333，故其相對分子質(zhì)量為332，目前的文獻(xiàn)報道[24]Monaphilone B的相對分子質(zhì)量為332，最大吸收波長為229和384 nm。組分的B的最大吸收波長分別為235和389 nm，與文獻(xiàn)報道的最大吸收波長存在差異。

經(jīng)質(zhì)譜分析確定了組分A與組分B的相對分子質(zhì)量，目前已知的與組分A同分異構(gòu)的紅曲色素有4種，而組分B的相對分子質(zhì)量僅與1種已知組分吻合，但最大吸收波長存在差異。因此，進(jìn)一步通過核磁共振分析對組分A和組分B的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以確定其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.5 核磁共振分析

核磁共振分析中，可通過一維核磁，即氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)給出未知物質(zhì)分子中氫原子和碳原子的化學(xué)位移信息，通過二維核磁，即COSY譜、HSQC譜和HMBC譜分別給出的相鄰氫、相鄰碳?xì)浜瓦h(yuǎn)程碳?xì)涞鸟詈详P(guān)系，來鑒定未知物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。

2.5.1 一維核磁分析

如圖4所示,組分A的氫譜數(shù)據(jù)為δ 0.89(3H，J=7.2，t)，δ1.30(4H，m)，δ1.45(3H，s)，δ1.62(2H，m)，δ1.87(3H，J=7.2，d)，δ2.44(1H，J=18.0，11.8，dd)，δ2.60(1H，J=18.0，7.2，dt)，δ2.67(1H，J=17，4，dd)，δ3.01(1H，J=18，7.2，dt)，δ3.23(1H，m)，δ3.67(1H，J=13.2，d)，δ4.72(1H，J=12.6，d)，δ5.06(1H，J=12.6，d)，δ5.27(1H，s)，δ5.90(1H，J=15.4，d)，δ6.50(1H，J=22.4，7.2，dt)。組分A的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9，δ17.7，δ18.5，δ22.4，δ22.8，δ29.4，δ31.2，δ42.9，δ54.9，δ63.8，δ83.2，δ103.3，δ114.0，δ124.4，δ135.4，δ150.8，δ160.5，δ169.5，δ189.8，δ202.5。結(jié)合氫譜和碳譜的數(shù)據(jù)，可知組分A有21個碳原子，26個氫原子，其相對分子質(zhì)量為358，所以可知組分A的分子式為C21H26O5。

組分B的氫譜數(shù)據(jù)為δ0.89(3H，J=7.2，t)，δ1.16(3H，s)，δ1.28(4H，m)，δ1.58(2H，m)，δ1.86(3H，J=7.2，d)，δ2.10(1H，J=20，12.2，dd)，δ2.40(3H，m)，δ2.60(2H，m)，δ2.97(1H，J=17，d)，δ4.76(1H，J=12.4，d)，δ5.01(1H，J=12.4，d)，δ5.22(1H，s)，δ5.89(1H，J=15.4，d)，δ6.47(1H，J=22.4，7.2，dt)。組分B的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9，δ18.4，δ19.9，δ22.4，δ23.5，δ31.4，δ32.6，δ39.4，δ42.0，δ43.2，δ64.0，δ74.1，δ103.4，δ113.0，δ124.7，δ134.7，δ152.5，δ160.4，δ197.9，δ210.1。組分B有20個碳原子，28個氫原子，其相對分子質(zhì)量為332，所以可知組分B的分子式為C20H28O4。組分A和組分B可能為紅曲素和Monaphilone B，但部分氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]存在差異，且最大吸收波長不一致，推測組分A和組分B有可能分別為紅曲素和Monaphilone B的同分異構(gòu)體，將進(jìn)一步采用二維核磁分析以確定組分A與組分B的分子結(jié)構(gòu)。

2.5.2 二維核磁分析

根據(jù)碳譜數(shù)據(jù)，組分A有20個碳核，分別以1～20編號，但C8有裂峰，實際有2種碳，分別編號為C8a和C8b。根據(jù)化學(xué)位移可知，C12、C13、C14、C15、C16和C17為雙鍵上的碳，C18、C19和C20為羰基碳。結(jié)合HSQC圖譜(圖5)，H1與C1相連，H2與C4，C7相連，H3與C2相連，H4與C5相連，H5與C3相連，H6與C6相連，H7a與C8a相連，H7b與C6相連，H8與C8a相連，H9與C8b相連，H10與C9相連，H11、H12與C10相連，H13與C12相連，H14與C14相連，H15與C15相連，C11、C13、C16、C17、C18、C19、C20沒有氫原子與之相連。H11和H12為C10上的2個氫，H6和H7b為C6上的2個氫，H7a和H8為C8a上的2個氫。

分析A的HMBC圖譜，可知H3與C8b、C11和C19耦合，表明C8b、C11和C19為C2的鄰位碳和間位碳；H7a、H8與C5、C7和C20耦合，所以戊烷基與羰基(C20)相連；H9與C6、C9、C11、C19和C20耦合；H10與C6、C8b、C18和C20耦合，C6、C8b、C18和C20為C9的鄰位碳和間位碳。H11、H12與C13、C16、C17和C19耦合，H13與C6、C10、C13、C14、C16、C17和C9耦合。

結(jié)合組分A的氫譜、碳譜、COSY譜、HSQC譜和HMBC譜，以及二維核磁數(shù)據(jù)(表2)，最終確定組分A為紅曲素，分子結(jié)構(gòu)圖如圖6所示。

與組分A二維核磁的分析方法相同，對組分B的COSY譜、HSQC譜和HMBC譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

根據(jù)組分B的二維核磁數(shù)據(jù)(表3)，最終確定該組分為Monaphilone B，分子結(jié)構(gòu)圖如圖7所示。

2.6 紅曲黃色素分子結(jié)構(gòu)對其吸收波長的影響

分離得到的紅曲素與Monaphilone B經(jīng)紫外-可見光分光光度計在200～600 nm波長范圍進(jìn)行全波長掃描，紅曲素的最大吸收波長為235和394 nm，Monaphilone B的最大吸收波長為235和389 nm(圖8)，與HPLC檢測結(jié)果一致。

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)式可知，紅曲素與Monaphilone B的主體結(jié)構(gòu)基本一致，是1個具有延伸共軛雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)(圖9)。

根據(jù)α,β-不飽和酮的吸收規(guī)則[25]可以推算紅曲黃色素組分的最大吸收波長λmax：推理過程如下，α,β-不飽和酮的基本吸收波長為215 nm，該結(jié)構(gòu)上增加了2個共軛雙鍵，增量為30×2 nm；且延伸的2個共軛雙鍵在同1個環(huán)內(nèi)，故吸收波長增加39 nm；由于α位點、β位點和ζ位點均有烷基取代，所以吸收波長分別增加10、12 nm和18 nm；δ位點上存在1個烷氧基取代，所以吸收波長增加31 nm；紅曲素分子中存在1個內(nèi)酯五元環(huán)與α,β-不飽和酮六元環(huán)連接，故吸收波長增加6 nm，因此紅曲素理論最大吸收波長為391 nm，與實測吸收波長394 nm基本吻合，而Monaphilone B分子結(jié)構(gòu)中沒有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，所以其理論最大吸收波長為385 nm，與實測吸收波長389 nm基本吻合。紅曲素和Monaphilone B同時在235 nm處有強吸收，根據(jù)紅曲素在235 nm處存在1個強吸收，根據(jù)共軛多烯類化合物的吸收規(guī)則[25]，紅曲素和Monaphilone B中鏈狀共軛二烯基本吸收值為217 nm，由于存在2個烷基取代和1個烷氧基取代，分別增加5×2 nm和6 nm，所以理論最大吸收波長為233 nm，與實測波長235 nm基本一致。

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵液的粗提物中萃取得到高色價的紅曲黃色素油樹脂，以高效液相色譜為分離純化，其色價高達(dá)9 100 U/g，萃取率為63.50%，具有較高的應(yīng)用價值。分析型高效液相色譜最佳分離條件為80%甲醇等度洗脫，流速為0.5 mL/min下，在液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素中檢測出2種主要色素組分，色素組分之間分離度為2.51，且不受雜質(zhì)峰影響，分離效果較好。制備型高效液相色譜最佳的分離條件為70%甲醇等度洗脫，流速為4 mL/min，2種組分純度分別為98.95%和99.02%，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的要求(>97%)。通過液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析，最終確定分離得到的2種色素組分為紅曲素(C21H26O5)和Monaphilone B(C20H28O4)，發(fā)酵液的粗提物中的紅曲黃色素主要色素組分為紅曲素，紅曲黃色素的顯色性能來自于分子結(jié)構(gòu)中具有延伸雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)。