李雪嬌，李欣芮，范卓妍，張亞妮，車會蓮*

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

小麥蛋白在小麥籽粒中占10%～15%，是小麥籽粒中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，各蛋白質(zhì)組分按其在不同溶劑中的溶解度不同分為4 類：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白[1-2]。小麥致敏機(jī)制比較復(fù)雜，不同種類的小麥蛋白都有可能引起過敏反應(yīng)，有不同的致敏性及發(fā)病機(jī)制，并呈現(xiàn)不同的臨床癥狀[3]。流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示，近年來過敏性疾病的發(fā)病率逐年升高，世界0.4%人口受小麥過敏癥困擾[4]。北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)布的中國過敏性休克誘因研究表明，超七成致敏源來自食物，其中以小麥居多[5]。小麥過敏會影響內(nèi)臟、呼吸道與皮膚的健康，引起運(yùn)動(dòng)激發(fā)過敏癥、乳糜瀉、哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻疹等[6]。

有研究表明，CM16是引起日本面包師哮喘的主要過敏原[7]，并且可以引發(fā)剛攝入輔食的嬰幼兒發(fā)生口服性的過敏反應(yīng)[8]。CM16分子質(zhì)量17 kDa，由143 個(gè)氨基酸組成，屬于醇溶蛋白超家族中的大型谷物胰蛋白酶或α-淀粉酶抑制劑家族[9]。該家族蛋白質(zhì)廣泛存在于谷類、豆類以及其他較高等植物中，對胰淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用[10]。

B細(xì)胞表位是抗原中可被B細(xì)胞抗原受體或抗體特異性識別并結(jié)合的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，其刺激機(jī)體產(chǎn)生B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生效應(yīng)分子（抗體）和效應(yīng)細(xì)胞[11]。在免疫學(xué)中，表位才是抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的真正部位[12]。B細(xì)胞表位預(yù)測是表位預(yù)測的一個(gè)重要組成部分，大多數(shù)研究是針對線性B細(xì)胞表位預(yù)測，通過組合抗原蛋白物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、統(tǒng)計(jì)顯著性度量等特征屬性進(jìn)行表位預(yù)測[13-14]。

通過生物信息學(xué)軟件分析抗原表位是目前常用的表位研究方法之一。其原理是對已知的線性B細(xì)胞表位特點(diǎn)進(jìn)行歸納后，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列中親水性和表面可及性高的區(qū)域更容易分布在分子表面，而可塑性高的區(qū)域容易發(fā)生折疊和扭曲，易與抗體接觸，可能產(chǎn)生抗原表位[15-17]。但該方法主要基于蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列，忽略了氨基酸之間的分子作用力，具有一定的局限性，需要結(jié)合抗消化實(shí)驗(yàn)以及質(zhì)譜分析加以驗(yàn)證。

因此，本研究擬利用生物信息學(xué)法預(yù)測CM16線性B細(xì)胞表位，與質(zhì)譜得到的抗消化肽段信息進(jìn)行比對，以期證明抗消化性結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定過敏原線性B細(xì)胞表位的方法的可行性和應(yīng)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用小麥粉為中糧香雪美味富強(qiáng)粉。

BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker 美國Thermo Fisher公司；牛血清白蛋白、胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P3292） 美國Sigma公司；0.22 μm硝酸纖維素膜美國Whatman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-3磁力攪拌器 上海富磁新徑儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī) 廣州廣一科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；DYY-7C型電泳儀 北京市六一儀器廠；GenoSens 1850凝膠成像分析系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；CC-K6加熱制冷型恒溫水浴鍋 德國Huber公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥蛋白粗提物的制備

參考冼靜雯等[18]的方法提取小麥蛋白粗提物。稱取約100 g小麥粉，1∶5（g/mL）加入預(yù)冷丙酮于4 ℃去脂，至上清液澄清，通風(fēng)櫥下干燥，稱質(zhì)量，以1∶10（g/mL）的比例加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，提取12～24 h，10 000×g離心10 min，上清液即為蛋白粗提物溶液。

1.3.2 生物信息學(xué)方法預(yù)測小麥過敏原CM16線性B細(xì)胞表位序列

從Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取小麥過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16的氨基酸序列。使用生物信息學(xué)軟件DNAStar Protean中Hoop-woods的氨基酸親水性分析方案、Emini-Surface Probability的表面可及性算法、Kparlus-Schuzl的可塑性分析和Jameson-Wolf的抗原指數(shù)分析方案，對蛋白質(zhì)的一級序列性質(zhì)進(jìn)行分析，綜合分析這些參數(shù)預(yù)測結(jié)果的重疊部分后，得出過敏原的線性B細(xì)胞表位序列[19]。

1.3.3 生物信息學(xué)方法分析小麥過敏原CM16二級結(jié)構(gòu)

使用DNAStar Protean載入NCBI中下載的FASTA格式的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16氨基酸序列，使用Chou-Fasman和Garnier-Robson方案對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.3.4 基于生物信息學(xué)方法的小麥過敏原CM16同源建模

在PDB數(shù)據(jù)庫中使用BLAST搜索與過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16同源性較高，且已由實(shí)驗(yàn)分析出高級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)序列。以相似度最高的蛋白質(zhì)為模板，使用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站進(jìn)行相同結(jié)構(gòu)區(qū)域的同源建模，根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬和能量最小化原理優(yōu)化得到最佳蛋白高級結(jié)構(gòu)。使用Spdbv軟件對模擬結(jié)構(gòu)的拉氏構(gòu)象圖進(jìn)行合理性分析，使用Pymol軟件對預(yù)測線性B細(xì)胞表位及抗消化肽段區(qū)域進(jìn)行空間定位。

1.3.5 小麥蛋白粗提物抗消化肽段的質(zhì)譜分析

分別取經(jīng)過胃蛋白酶或胰酶消化60 min后的小麥粗蛋白消化產(chǎn)物，進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，鑒定氨基酸長度多于4 個(gè)的抗消化肽段，并確定多肽所屬的蛋白質(zhì)序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖表繪制工具主要為DNAStar軟件、Spdbv軟件version 4.1（http - //spdbv.vital-it.ch/）、Pymol軟件version 2.2（http-//www.pymol.org/）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥粗蛋白提取物主要成分分析

小麥蛋白粗提物電泳結(jié)果顯示，小麥總蛋白具有5 條明顯的電泳條帶，其中分子質(zhì)量在17 kDa的蛋白質(zhì)含量最高，經(jīng)灰度值分析，約占總蛋白含量的40%，其分子質(zhì)量對應(yīng)小麥過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16。由圖1可知，小麥蛋白粗提物主要是由17 kDa處的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16和大于180 kDa的高分子質(zhì)量谷蛋白低聚物組成，這兩種蛋白質(zhì)具有熱穩(wěn)定性，經(jīng)37 ℃溫育60 min后，含量未發(fā)生明顯變化。在胃蛋白酶作用下，消化第30秒時(shí)，高分子質(zhì)量谷蛋白低聚物迅速被降解，產(chǎn)生分子質(zhì)量低于10 kDa的片段，而17 kDa處的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16在第30秒時(shí)保持完整，第5分鐘時(shí)才被完全降解。隨著消化進(jìn)行，低于10 kDa的抗消化片段直至消化結(jié)束時(shí)仍可被檢測。結(jié)果表明，高分子質(zhì)量谷蛋白低聚物極易被胃蛋白酶消化，α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16易被消化，但小麥過敏原在消化過程中會產(chǎn)生消化抗性片段，具有潛在致敏活性。因此后續(xù)選取α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16進(jìn)行線性B細(xì)胞表位與抗消化肽段之間關(guān)系的研究。

圖1 胃蛋白酶消化對小麥蛋白質(zhì)粗提物的影響Fig. 1 Effect of pepsin digestion on WPE

2.2 小麥過敏原CM16可能線性B細(xì)胞表位的預(yù)測結(jié)果

一般認(rèn)為，親水性和表面可及性高的區(qū)域易分布在蛋白質(zhì)分子的表面，且柔性區(qū)域易于發(fā)生折疊和扭曲，容易產(chǎn)生表位與抗體結(jié)合[20]。如圖2所示，在氨基酸親水性分析中，親水性指數(shù)大于0表明親水性好，CM16的親水性區(qū)域分布較為均勻，其中親水性較高的區(qū)域分別為AA 88～100和AA 137～143。在可塑性分析中，發(fā)現(xiàn)AA 26～32、AA 39～51、AA 54～62、AA 64～67、AA 75～78、AA 89～98、AA 103～108、AA 130～132和AA 138～140區(qū)域具有一定的柔性，容易發(fā)生折疊、彎曲，易與抗體結(jié)合。在抗原指數(shù)分析中，以抗原指數(shù)大于0為篩選條件，結(jié)果顯示抗原指數(shù)較高的區(qū)域?yàn)锳A 26～34、AA 42～63、AA 66～70、AA 71～84、AA 88～99、AA 100～111和AA 137～143，可能含有潛在的優(yōu)勢抗原表位。最后對于CM16的表面可及性進(jìn)行了分析，表面可及性指數(shù)大于1為篩選條件，結(jié)果顯示AA 47～50、AA 58～60、AA 62～65、AA 90～96和AA 138～143區(qū)域具有較好的表面可及性。綜合以上各參數(shù)，將同時(shí)滿足4 個(gè)參數(shù)篩選條件的表位預(yù)測為CM16可能的線性B細(xì)胞表位，如表1所示。

圖2 DNAStar對CM16一級氨基酸序列的分析Fig. 2 DNAStar analysis of the amino acid sequence of CM16

表1 DNAStar預(yù)測得到的CM16的線性B細(xì)胞表位Table 1 Predicted linear B-cell epitopes of CM16 by DNAStar

2.3 過敏原CM16線性B細(xì)胞表位的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖3 CM16的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Prediction of CM16 secondary structure

圖3 為使用DNAStar軟件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案對CM16二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果[21]。分析可知，兩種方案在預(yù)測CM16的轉(zhuǎn)角區(qū)域時(shí)具有一定的相似性，但對于α-螺旋和β-折疊的預(yù)測具有基本相反的結(jié)果，還需要結(jié)合三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析?？傮w來看，CM16蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中有序的螺旋、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占據(jù)了主要優(yōu)勢，反映了蛋白質(zhì)具有良好的緊密結(jié)構(gòu)。

2.4 過敏原CM16預(yù)測線性B細(xì)胞表位的空間定位

使用PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，對小麥α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16的氨基酸序列進(jìn)行BLAST檢索，共檢索到16 種已有空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)序列，其中PDB檢索號為1bfa.1.A的重組玉米雙功能蛋白因子/淀粉酶抑制劑與CM16的序列相似性可達(dá)41.88%，具有較高的序列覆蓋率，模擬結(jié)構(gòu)評分最高，因而被選為CM16建模的最佳模板。拉氏構(gòu)象圖是α-碳與酰胺平面的交角圖，可以評價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)角的易變程度。通過了解氨基酸殘基的Φ和Ψ角信息，獲得拉氏構(gòu)象圖的允許構(gòu)象和不允許構(gòu)象區(qū)域，如圖4所示。在空間上允許和不允許出現(xiàn)的區(qū)域用不同顏色的等高線表示，黃色封閉區(qū)域?yàn)樵试S區(qū)，構(gòu)象最為穩(wěn)定，在該區(qū)域內(nèi)的任何成對二面角（φ，ψ）所規(guī)定的構(gòu)象都是立體化學(xué)所允許的[22]。藍(lán)色封閉區(qū)域?yàn)榕R界區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何成對二面角所規(guī)定的構(gòu)象雖然是立體化學(xué)所允許的，但不夠穩(wěn)定，除此之外的區(qū)域?yàn)椴辉试S區(qū)[23]。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)氨基酸殘基，紅色點(diǎn)為組成α-螺旋的氨基酸，黃色為β-折疊。由圖4可知，α-螺旋主要集中于第3象限的允許區(qū)域內(nèi)，而β-折疊主要集中于第2象限的允許區(qū)域內(nèi)。由此可證，CM16的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成。只有6 個(gè)點(diǎn)位于不允許區(qū)域，8 個(gè)點(diǎn)位于藍(lán)色的臨界區(qū)域，其他多位于黃色的允許區(qū)域內(nèi)，允許區(qū)域的氨基酸覆蓋率達(dá)88%，此結(jié)果表明，構(gòu)建的CM16的三維結(jié)構(gòu)在一定程度上具有合理性和穩(wěn)定性。

圖4 拉氏構(gòu)象圖Fig. 4 Ramachandran plot of three-dimensional model of CM16

利用Pymol軟件對生物信息學(xué)模擬的CM16線性B細(xì)胞表位在其空間結(jié)構(gòu)上進(jìn)行定位[24]，將生物信息學(xué)模擬的4 條線性B細(xì)胞表位按不同顏色標(biāo)注在三維結(jié)構(gòu)圖上（圖5）。圖5A為卡通拓?fù)鋱D，彩色區(qū)域是不同抗消化肽段在其中的定位。CM16的空間結(jié)構(gòu)是由4 個(gè)分子內(nèi)的α-螺旋以及其他無序結(jié)構(gòu)組成的，具有醇溶蛋白超家族典型的結(jié)構(gòu)特性。由二硫鍵形成α-螺旋在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起到非常重要的作用，使CM16蛋白形成致密的球狀分子，為其致敏性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。除標(biāo)注為紅色的表位位于α-螺旋上以外，其他的3 個(gè)表位均位于無規(guī)卷曲處，構(gòu)象上具有可塑性，容易與抗體接觸形成表位。圖5B顯示CM16表面分子暴露情況，4 個(gè)預(yù)測的線性表位均位于球狀結(jié)構(gòu)表面，具有與抗體結(jié)合的表面可及性，可以形成線性B細(xì)胞表位。綜上可知，CM16的線性B細(xì)胞表位多位于無規(guī)卷曲處或是α-螺旋與無規(guī)卷曲的連接處，具有可塑性及表面可及性。

圖5 預(yù)測線性B細(xì)胞表位在CM16三維結(jié)構(gòu)中的定位Fig. 5 Location of the predicted linear B-cell epitopes in CM16 3D structure

2.5 過敏原CM16可能線性B細(xì)胞表位與抗消化肽段的比較

將小麥蛋白粗提物經(jīng)胃蛋白酶消化60 min后的產(chǎn)物，通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行鑒定。經(jīng)過60 min的胃蛋白酶消化，共產(chǎn)生6 753 個(gè)二級質(zhì)譜圖。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫提供的小麥過敏原氨基酸序列構(gòu)建檢索數(shù)據(jù)庫，使用pFind軟件搜索，共鑒定出23 條屬于過敏原蛋白的片段，且大部分來源于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑亞型和高分子質(zhì)量谷蛋白亞基，α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑亞型CM16的主要過敏原肽段如表2所示。

表2 胰酶消化質(zhì)譜與小麥主要過敏原匹配的肽段Table 2 Matching of trypsin-digested peptides with wheat major allergens

將預(yù)測表位與抗消化肽段在過敏原CM16的一級氨基酸序列上分布進(jìn)行標(biāo)注，如圖6所示，預(yù)測表位和抗消化肽段主要分布于中部和C末端，而1、2號抗消化肽段與2、3號預(yù)測表位有部分序列重合，證明了預(yù)測表位的抗消化性，也體現(xiàn)了表位與抗消化肽段之間的聯(lián)系。

圖6 抗胰酶消化肽段及預(yù)測表位在CM16氨基酸序列的定位Fig. 6 Location of anti-trypsin-digested peptides and predicted epitopes in amino acid sequence of CM16

3 討 論

本研究首先對小麥蛋白質(zhì)粗提物進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在17 kDa的小麥過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16量最高，約占總蛋白含量的40%。進(jìn)一步進(jìn)行體外模擬胃腸道分析，結(jié)果顯示小麥過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16在模擬消化過程中會產(chǎn)生消化抗性片段，提示其可能具有潛在的致敏活性。Posch等[20]使用雙方電泳法分離出小麥過敏原，經(jīng)過氨基酸序列檢測，確定其主要過敏原為14～18、27 kDa和37 kDa處的蛋白，這與本研究結(jié)果一致。

為研究小麥中的醇溶蛋白超家族過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16的線性B細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu)特征，通過生物信息學(xué)方法對小麥過敏原CM16的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行探究。首先通過DNAStar對CM16一級氨基酸序列進(jìn)行分析，通過篩選，最終確定了4 個(gè)CM16的線性B細(xì)胞表位。盡管近年來B細(xì)胞表位預(yù)測的方法得到了一定的發(fā)展和應(yīng)用，但這些研究方法還存在一定的問題[25-26]。首先，所有預(yù)測表位的方法都缺乏評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這使得各種預(yù)測方法的結(jié)果難以比較與評估[27]。其次，90%以上的表位為構(gòu)象表位[28]，然而大多數(shù)預(yù)測線性表位的方法都具有一定的局限性，它們僅僅是根據(jù)少數(shù)的幾個(gè)表位的特征（氨基酸的性質(zhì)、殘基的表面可及性、空間分布、分子間接觸）預(yù)測表位[29-30]。有研究結(jié)果表明[31]，僅根據(jù)氨基酸的性質(zhì)來預(yù)測線性表位的方法并不可靠，要提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，需與非表位特征結(jié)合起來預(yù)測。

因此，本研究進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測CM16的二級結(jié)構(gòu)，并通過同源建模確定CM16的三級結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步完善線性B細(xì)胞表位預(yù)測研究的基礎(chǔ)上，深入研究了線性表位的構(gòu)象分布。結(jié)果表明，CM16是由4 個(gè)α-螺旋以及無規(guī)卷曲組成的球狀結(jié)構(gòu)，預(yù)測的線性B細(xì)胞表位則位于無規(guī)卷曲處或是α-螺旋與無規(guī)卷曲的連接處，且暴露于球狀結(jié)構(gòu)的表面，具有表面可及性及結(jié)構(gòu)可塑性。

為探究生物信息學(xué)方法預(yù)測線性B細(xì)胞表位的抗消化肽段的可行性，本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測出CM16的4 條線性B細(xì)胞表位后，結(jié)合質(zhì)譜得到的抗消化肽段信息進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其中2 條肽段存在部分重合，含有線性B細(xì)胞表位的可能性更高，也證明了抗消化性結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定過敏原線性B細(xì)胞表位的方法的可行性和應(yīng)用性。

4 結(jié) 論

小麥中的醇溶蛋白超家族過敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑CM16是由4 個(gè)α-螺旋以及無規(guī)卷曲組成的球狀結(jié)構(gòu)，其線性B細(xì)胞表位則位于無規(guī)卷曲處或α-螺旋與無規(guī)卷曲的連接處，且暴露于球狀結(jié)構(gòu)的表面，具有表面可及性及結(jié)構(gòu)可塑性。探究小麥過敏原CM16線性B細(xì)胞表位有助于進(jìn)一步認(rèn)識小麥過敏原，對小麥過敏原的識別和檢測具有重要的參考和借鑒作用。