葉玉潔，石 光，周正乙，王佳琪，發(fā)麗萍*，杜培革*

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

桑黃（Phellinus igniarius）是針層孔菌屬真菌火木層孔菌，是一種珍貴的多年生大型藥用真菌，又名桑寄生、桑臣、桑耳、樹(shù)雞、胡孫眼、桑黃菰、桑黃菇等[1-2]。桑黃作為我國(guó)傳統(tǒng)的應(yīng)用型中藥材之一，藥用最早回載于李時(shí)珍《本草綱目》中，性甘、平、味苦、味辛，歸肝、膀胱經(jīng)[3]，是目前公認(rèn)的抗癌效率較高的一種藥用大型真菌，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，有“森林黃金”之美稱[4-6]。

傳統(tǒng)上，桑黃的活性成分是從子實(shí)體中提取[7-8]，但受生理生態(tài)的特殊性和復(fù)雜性以及外部環(huán)境條件的制約，桑黃在自然界中形成子實(shí)體稀少，特別是形成可用子實(shí)體需要多年，人工栽培難度較大，資源匱乏[9-10]。因此，桑黃的開(kāi)發(fā)和利用也受到限制，采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃菌絲體成為研究熱點(diǎn)[11-12]。

本研究對(duì)桑黃液體發(fā)酵菌絲體和野生桑黃子實(shí)體的基本營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸和微量元素的組成，以及多糖、黃酮類、三萜類物質(zhì)含量進(jìn)行對(duì)比分析和評(píng)價(jià)[13]，為桑黃作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)，以期獲得桑黃菌更重要的應(yīng)用價(jià)值和更為廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃菌（菌株編號(hào)ACCC 52364）來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，來(lái)源中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，由PDB培養(yǎng)液液體搖瓶發(fā)酵獲取[14]。

野生桑黃子實(shí)體購(gòu)自延吉百納和商貿(mào)有限公司，經(jīng)北華大學(xué)李鳳麗教授鑒定為長(zhǎng)白山野生桑黃子實(shí)體；結(jié)腸癌SW620細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞由北華大學(xué)生命科學(xué)中心提供。

PDA培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司；PDB培養(yǎng)基、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京索萊寶生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoMixer C型恒溫振蕩器 德國(guó)Eppendorf公司；立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；Infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；BenchTop Pro臺(tái)式冷凍干燥機(jī)美國(guó)Virtis公司；全自動(dòng)氨基酸分析儀、原子發(fā)射光譜儀北華大學(xué)分析測(cè)試中心；K1100F全自動(dòng)凱氏定氮儀濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃菌絲體培養(yǎng)

菌種活化：將桑黃母種用接種環(huán)取出，接種于PDA固體培養(yǎng)基中活化，于28 ℃培養(yǎng)7 d，濕度適宜。用0.5 cm2活化后的斜面母種，再接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后即為菌種液。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將菌種液接至PDB培養(yǎng)液中，接種量為10%，在250 mL燒瓶中裝液100 mL，于28 ℃轉(zhuǎn)速150 r/min搖床中培養(yǎng)10 d，抽濾，蒸餾水洗滌5 次，回集菌絲體，冷凍干燥。

1.3.2 水分測(cè)定

減重法測(cè)定水分含量[15]，分別取桑黃菌絲體、子實(shí)體約5 g，平鋪于干燥至恒定質(zhì)量的稱量瓶中，精密稱定；開(kāi)啟瓶蓋于105 ℃干燥，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，重復(fù)上述操作直至恒定質(zhì)量，根據(jù)減失的質(zhì)量，計(jì)算含水量，平行測(cè)定3 組數(shù)據(jù)。

1.3.3 灰分測(cè)定

灼燒法測(cè)定灰分含量[16]，分別取桑黃菌絲體、子實(shí)體粉末約3 g，置熾灼至恒定質(zhì)量的坩堝中，精密稱定，500 ℃熾熱至完全炭化并恒定質(zhì)量，精密稱定，根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算總灰分含量，平行測(cè)定3 組數(shù)據(jù)。

1.3.4 粗蛋白測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量[17]，稱取干燥至恒定質(zhì)量的桑黃菌絲體、子實(shí)體粉末約2 g，置于消解管中，濃硫酸浸泡24 h后，消解儀150 ℃消煮3 h。加入雙氧水若干，待溶液顏色變成無(wú)色透明或淡黃色，加熱溫度改為300 ℃，揮去黃煙后停止加熱，冷卻后置于全自動(dòng)凱氏定氮儀中，平行測(cè)定3 組數(shù)據(jù)。

1.3.5 粗脂肪測(cè)定

采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量[18]，稱取干燥至恒定質(zhì)量的桑黃菌絲體、子實(shí)體粉末約5 g，精密稱定，用濾紙包裹置于恒定質(zhì)量抽提瓶中回流提取10 h。提取完成后，取出濾紙包，蒸餾得淡黃色的粗脂肪，烘干至恒定質(zhì)量，計(jì)算粗脂肪含量，平行測(cè)定3 組數(shù)據(jù)。

1.3.6 粗纖維測(cè)定

采用酸性洗滌法測(cè)定粗纖維含量[19]，稱取干燥至恒定質(zhì)量的桑黃菌絲體、子實(shí)體粉末約5 g，精密稱定，置于500 mL錐形瓶中，加入200 mL煮沸的體積分?jǐn)?shù)為1.25%的硫酸，維持體積恒定回流30 min，抽濾，沸水洗滌至溶液呈中性，殘留物用20 mL煮沸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%的氫氧化鈉溶液回流30 min，抽濾，沸水洗滌至溶液呈中性，依次再用無(wú)水乙醇、乙醚洗滌2 次，移入干燥至恒定質(zhì)量的坩堝中，于105 ℃烘干至恒定質(zhì)量，計(jì)算粗纖維含量，平行測(cè)定3 組數(shù)據(jù)。

1.3.7 氨基酸、礦物元素成分分析

氨基酸和礦物元素分別采用氨基酸全自動(dòng)分析儀[20]和微波消解ICP-AES法測(cè)定[21]。

1.3.8 粗多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[22]，取桑黃菌絲體及子實(shí)體于50 ℃干燥至恒定質(zhì)量，平行稱取3 組，熱水提取，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間4 h，料液比1∶40（V/V），提取次數(shù)3 次，合并濾液，減壓濃縮，80%乙醇溶液醇析沉淀，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.9 粗黃酮含量測(cè)定

取桑黃菌絲體及子實(shí)體于50 ℃干燥至恒定質(zhì)量，平行稱取3 組，60%乙醇溶液提取，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h，料液比1∶30（V/V），然后過(guò)濾得桑黃醇提物。取適量醇提物溶于70%乙醇溶液，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定黃酮含量[23]。

1.3.10 粗三萜含量測(cè)定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用冰乙酸-香草醛測(cè)定三萜含量[24]。精密稱定1.3.9節(jié)桑黃醇提物約1 g，平行稱取3 組，置100 mL容量瓶中，加氯仿50 mL萃取6 h，萃取2 次，合并濾液，減壓濃縮至干，用無(wú)水乙醇溶解。

1.3.11 主要功能成分活性比較

1.3.1 1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測(cè)定

通過(guò)DPPH自由基清除率比較3 種活性成分體外抗氧化活性[25]。取稀釋到不同質(zhì)量濃度的樣品100 μL加入到96 孔板中，加入DPPH溶液100 μL，充分搖勻后避光處理，置于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，比較活性最高成分。DPPH自由基清除率計(jì)算如式（1）所示：

式中：Ax為不同質(zhì)量濃度樣品+DPPH吸光度；Ay為不同質(zhì)量濃度樣品+蒸餾水吸光度；A0為蒸餾水+DPPH吸光度。

1.3.1 1.2 活性成分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

SW620細(xì)胞用含有10%胎牛血清（fatal bovine serun，F(xiàn)BS）的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，HepG2細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用MTT法[26]檢測(cè)DPPH自由基清除率最高成分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)（5×106個(gè)/孔），培養(yǎng)48 h，SW620和HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組和多糖（50、100、200、500、1 000 mg/mL）組，對(duì)照組細(xì)胞加入培養(yǎng)液，其余各組細(xì)胞分別加入上述質(zhì)量濃度桑黃多糖，培養(yǎng)24 h后加入MTT，4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。細(xì)胞抑制率按式（2）計(jì)算：

式中：Ax為實(shí)驗(yàn)組吸光度；Ay為對(duì)照組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃菌絲體培養(yǎng)

圖1 桑黃菌絲體培養(yǎng)Fig. 1 Mycelial culture of P. igniarius

PDA固體培養(yǎng)基中可觀察到桑黃菌絲體生長(zhǎng)新區(qū)呈鋸齒狀（曲線所示），輕微升起的氣生菌絲體延伸到生長(zhǎng)區(qū)的邊緣（箭頭所示），菌落白色至微帶奶油黃色、黃褐色、蜜黃色邊緣絨毛狀，反面無(wú)變化（圖1A）；較老的部位為棉花狀和羊毛狀、氈狀，反面奶油黃色至黃褐色（圖1B）。PDB液體培養(yǎng)基中可觀察到桑黃菌絲體呈菌絲球狀態(tài)（圖1C），菌絲形態(tài)特征一致，均為多分支，可見(jiàn)菌絲橫隔，無(wú)鎖狀聯(lián)合（圖1D）。

2.2 主要營(yíng)養(yǎng)成分含量比較分析

桑黃菌絲體和子實(shí)體主要營(yíng)養(yǎng)成分含量比較如表1所示，菌絲體水分、灰分含量顯著低于子實(shí)體（P＜0.05），粗纖維含量極顯著低于子實(shí)體（P＜0.01），但粗脂肪和粗蛋白含量極顯著高于子實(shí)體（P＜0.01），均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 桑黃菌絲體與子實(shí)體主要營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較Table 1 Comparison of main nutrient contents in mycelium and fruit body of P. igniarius%

2.3 氨基酸含量分析

從表2可知，在所測(cè)定的17 種氨基酸中，桑黃菌絲體和子實(shí)體均含有人體必需的多種氨基酸，氨基酸種類齊全。桑黃菌絲體氨基酸總量為25.11%，子實(shí)體氨基酸總量為4.69%，桑黃菌絲體氨基酸總量高于子實(shí)體，且所檢測(cè)出的17 種氨基酸含量均高于子實(shí)體，其中菌絲體中Glu含量最高，為2.86%；子實(shí)體中Met含量最高，為0.66%。所檢出的7 種人體必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys總量分別占菌絲體、子實(shí)體氨基酸總量的38.99%、46.70%。

2.4 礦物元素分析

采用ICP-AES法快速測(cè)定Li、Na、Mg、Al、P、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Ba、Hg、Pb共24 種元素，檢出K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Cu、Mn、Ba、P、Cr、Sr共13 種元素，結(jié)果表明，菌絲體含K 98.440 0 mg/kg、Ca 239.281 0 mg/kg、Na 543.685 0 mg/kg、Mg 269.744 0 mg/kg、Al 2 2 4.4 2 7 0 m g/k g、Z n 2 1.6 1 5 0 m g/k g、F e 212.222 0 mg/kg、Cu 27.063 8 mg/kg、Mn 4.112 6 mg/kg、Ba 1.845 9 mg/kg、P 13 767.400 0 mg/kg、Cr 5.536 5 mg/kg、Sr 0.897 4 mg/kg；子實(shí)體含K 130.211 0 mg/kg、Ca 581.768 0 mg/kg、Na 57.718 8 mg/kg、Mg 349.221 0 mg/kg、Al 332.118 0 mg/kg、Zn 14.907 2 mg/kg、Fe 97.928 4 mg/kg、Cu 9.860 7 mg/kg、Mn 88.248 9 mg/kg、Ba 1.242 4 mg/kg、P 5 509.630 0 mg/kg、Cr 4.451 8 mg/kg、Sr 5.640 6 mg/kg，其中礦物元素含量比較分析如圖2所示。

圖2 桑黃菌絲體與子實(shí)體礦物元素比較Fig. 2 Comparison of contents of mineral elements in mycelium and fruit body of P. igniarius

2.5 主要功能成分比較分析

2.5.1 主要功能成分含量比較分析

表3 桑黃菌絲體與子實(shí)體主要功能成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較Table 3 Comparison of contents of main functional components in mycelium and fruit body of P. igniarius%

從表3可以看出，桑黃子實(shí)體主要功能成分均高于菌絲體，其中桑黃多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為30.48%。

2.5.2 主要功能成分活性比較分析

圖3 DPPH自由基清除體外抗氧化活性比較Fig. 3 Comparison of in vitro DPPH radical scavenging capacity of main functional components in mycelium and fruit body of P. igniarius

由圖3可以看出，質(zhì)量濃度在1.25 mg/mL時(shí)多糖達(dá)到最高清除率為77.14%，質(zhì)量濃度在0.625 mg/mL時(shí)黃酮達(dá)到最高清除率為61.37%，質(zhì)量濃度在1.25 mg/mL時(shí)三萜達(dá)到最高清除率為49.97%。

與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度桑黃菌絲體、子實(shí)體多糖SW620和HepG2細(xì)胞抑制率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組SW620和HepG2細(xì)胞抑制率（n=6，x±s）Table 4 Inhibition rates of SW620 and HepG2 cells by polysaccharides from mycelium and fruit body of P. igniarius (n= 6, x± s)

3 結(jié) 論

桑黃菌絲體中水分、灰分、粗纖維含量顯著或極顯著低于子實(shí)體，但菌絲體中粗脂肪、粗蛋白含量極顯著高于子實(shí)體（P＜0.01）；因?yàn)榈鞍缀康娘@著差異，導(dǎo)致桑黃菌絲體和子實(shí)體氨基酸含量差異較大，但二者均含有17 種氨基酸，種類豐富，且菌絲體氨基酸總量為25.11%，高于子實(shí)體氨基酸總量，可提供人體必需多種氨基酸，維持機(jī)體免疫力。此外，兩者均含有多種有益礦物元素，共檢測(cè)出13 種微量元素，其中包含Al、Na、Mg、Ca、K、P六種人體必需常量元素，F(xiàn)e、Zn、Cu、Mn、Cr、Se六種人體必需微量元素。多項(xiàng)研究報(bào)道桑黃菌絲體、子實(shí)體中均含有豐富的多糖、黃酮、三萜類物質(zhì)，為桑黃主要活性成分[27]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓等功效[28-29]。利用DPPH自由基體外清除率測(cè)定比較桑黃子實(shí)體中3 種主要功能成分的活性，分析得出桑黃多糖抗氧化活性較好；進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，對(duì)桑黃菌絲體、子實(shí)體多糖活性進(jìn)行比較，結(jié)果表明與野生桑黃子實(shí)體相比，菌絲體功能成分活性較低，其中多糖成分活性較好，具有抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增殖等功效[30-34]。研究表明液體發(fā)酵所得桑黃菌絲體同樣具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值，可為桑黃的進(jìn)一步深入研究提供基本數(shù)據(jù)。