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響應(yīng)面法優(yōu)化楓楊葉多糖醇提取工藝及其抗氧化活性研究

2020-01-07 07:45:32謝朋飛劉靜蔡延渠王俊杰張遠(yuǎn)芳
關(guān)鍵詞:楓楊光度乙醇

謝朋飛, 劉靜, 蔡延渠, 王俊杰, 張遠(yuǎn)芳

(1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部,湖南郴州 423000;2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心,廣東廣州 510006;3.湘南學(xué)院,湖南郴州 423000)

楓楊葉為胡桃科植物楓楊(Pterocarya stenoptera DC.)的葉,又名麻柳葉,分布于陜西、河南及長江流域以南地區(qū)。味苦,性溫,有小毒。具有止咳化痰、消炎解毒、殺蟲止癢的功效。主治慢性氣管炎、關(guān)節(jié)痛、瘡疽癤腫、疥癬風(fēng)癢、皮炎濕疹、湯火傷等病癥[1-2]?,F(xiàn)代研究[3-5]發(fā)現(xiàn),其具有抗腫瘤、抗病毒、殺滅釘螺等作用,主要成分有維生素、鞣質(zhì)、水楊酸、內(nèi)酯及酚類等化合物,但關(guān)于多糖類物質(zhì)則鮮少報(bào)道。因此,本研究采用加熱回流提取法,通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化楓楊葉多糖的乙醇提取工藝,同時(shí)評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性,以期為楓楊葉多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑 楓楊葉樣品采自湖南郴州,經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊(Pterocarya stenoptera DC.)的葉。D-無水葡萄糖對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110833-201707);三羥甲基氨基甲烷(Thris)、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(上海麥克林生化科技有限公司);鄰苯三酚、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀、抗壞血酸(Vc)、鹽酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯乙酸、氯化鐵均為分析純;水為實(shí)驗(yàn)室自制純水。

1.2 儀器 UV-1700雙光束紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);EPED-10TF純水器(南京益普易達(dá)科技發(fā)展有限公司);FreeZone2.5冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司);CP-225D電子天平(0.01 mg,德國賽多利斯公司);ME-204電子天平(0.000 1 g,瑞士梅特勒—托利多公司);JJ1000Y電子天平(美國雙杰集團(tuán)有限公司);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);BHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江陰市保利科研器械有限公司);pHS-3C pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定[6]

2.1.1 楓楊葉多糖制備 將楓楊葉干燥,粉碎成粗粉,稱取30 g粉末,加入20倍量60%乙醇(體積分?jǐn)?shù),下同)加熱提取2次,1 h/次,藥液75℃減壓濃縮至適量,定容為1 g(生藥)/mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品9.96 mg,加水配制成0.099 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于試管中,加水至1.0 mL;再加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸,90℃水浴20 min后取出冷卻至室溫,于490 nm處測(cè)定吸光度(D)值。同時(shí)以水為參比溶液進(jìn)行空白對(duì)照。D為縱坐標(biāo)、D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1),線性回歸得方程Y=0.069 0X+0.039 0,r=0.999 5,表明在1.422 9~11.382 9μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of glucose

2.1.3 多糖含量測(cè)定 按“2.1.1”項(xiàng)下操作制備楓楊葉多糖樣品溶液,按“2.1.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度D值,代入回歸方程計(jì)算多糖含量,根據(jù)以下公式計(jì)算多糖得率。楓楊葉多糖得率(%)=多糖質(zhì)量/楓楊葉質(zhì)量×100%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用加熱回流方法,分別考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。

2.2.1 乙醇濃度 考察40%、50%、60%、70%、80%等不同濃度乙醇溶液對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示:隨著乙醇濃度的升高,多糖得率逐漸提高;當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),多糖得率最高;隨后繼續(xù)提高乙醇濃度,多糖得率則隨著下降。推測(cè)可能是當(dāng)溶液極性下降,水溶性多糖的溶出率降低。具體變化趨勢(shì)見圖2。

2.2.2 提取溫度 考察60、70、80、90、100℃等不同提取溫度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示,楓楊葉多糖得率隨著溫度的升高而提高,當(dāng)溫度為100℃時(shí)達(dá)到最高值。具體變化趨勢(shì)見圖3。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 2 The effect of the different concentrations of ethanol on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖3 不同提取溫度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 3 The effect of the different extraction temperatures on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.3 料液比 考察1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50[(m/g)∶(V/mL),下同]等不同料液比對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示,楓楊葉多糖得率隨著溶劑用量的增加而提高,當(dāng)料液比為1∶40時(shí)接近最高值,隨后增加溶劑量,得率略微提高。具體變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 不同料液比對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 4 The effect of the different solid-liquid ratios on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.4 提取時(shí)間 考察0.5、1、2、3、4 h等提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示,在1~3 h內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長,多糖得率較為明顯地提高;4 h后,變化趨勢(shì)變緩,得率略微提高。其原因可能是溶液中多糖含量接近飽和,因此即使增加提取時(shí)間,多糖的溶解也較少。具體變化趨勢(shì)見圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 5 The effect of the different extraction time on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法[7-8]以多糖得率為響應(yīng)值指標(biāo),選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)為影響因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見表1,結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到楓楊葉多糖得率(Y)對(duì)三因素的回歸方程:Y=12.28-0.20A+0.27B+0.61C+0.01AB+0.010AC-0.14BC-1.18A2-0.59B2-0.53C2。

2.3.1 模型建立與方差分析 由表3結(jié)果可知,模型F值為78.35,P<0.000 1,表明該模型具有顯著性。同時(shí)模型失擬項(xiàng)值為0.638 6(P>0.05),表明模型擬合度良好。相關(guān)系數(shù)R2為0.990 2及失擬項(xiàng)系數(shù)R2Adj為0.775,均表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性良好。由F值可知,因素A、B、C對(duì)楓楊葉多糖得率有顯著影響(P<0.001),順序依次為C>B>A,三者間的交互項(xiàng)影響不顯著(P>0.05),表明楓楊葉多糖與各個(gè)因子之間不單單是線性關(guān)系。二次項(xiàng)A2、B2、C2亦影響顯著(均P<0.001)。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of response surface methodology test

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 由模型繪制各因素的等高線與響應(yīng)面,可以分析在最佳條件下不同變量的取值和各變量之間產(chǎn)生交互作用的顯著程度。由結(jié)果可知,乙醇濃度與提取時(shí)間的響應(yīng)面較為陡峭、等高線較為趨于橢圓形,表明因素間交互作用較為顯著,而其他因素間的交互作用則不顯著。具體見圖6。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件Design Expert 8.0分析所得楓楊葉多糖提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度59.39%、料液比1∶40.67,提取時(shí)間3.60 h、提取2次,預(yù)測(cè)多糖得率為12.47%。結(jié)合實(shí)際,調(diào)整最優(yōu)條件為乙醇濃度60%、料液比1∶40,提取時(shí)間3.5 h、提取2次。按此工藝進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得多糖得率為(12.12±0.08)%,與預(yù)測(cè)值接近,表明模型具有良好的預(yù)測(cè)性,且響應(yīng)面法優(yōu)化所得工藝條件準(zhǔn)確、可靠。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The variance analysis results of regression model

2.4 楓楊葉多糖抗氧化能力測(cè)定[9-10]稱取楓楊葉粗粉100 g,按照最佳工藝條件進(jìn)行提取,藥液80℃減壓濃縮至適量,冷凍干燥至恒質(zhì)量(7.52 g),研磨成粉,過100目篩,即得楓楊葉多糖。稱取適量楓楊葉多糖和Vc(陽性對(duì)照),分別用純水配成系列質(zhì)量濃度溶液,進(jìn)行不同抗氧化活性檢測(cè)。

2.4.1 清除DPPH·自由基能力測(cè)定 分別吸取1 mL的不同質(zhì)量濃度樣品溶液和0.5 mL的DPPH儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL)于試管中,室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光度D1值;吸取0.5 mL DPPH儲(chǔ)備液、1 mL純水,同法操作,測(cè)定吸光度D0值;吸取0.5 mL無水乙醇、1 mL樣品溶液,同法操作,測(cè)定吸光度D2值。根據(jù)下式計(jì)算清除率:清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:楓楊葉多糖,Y=0.062 3X+0.304 3(R2=0.985 4);Vc,Y=0.029 6X+0.345 5(R2=0.990 5)。計(jì)算IC50:楓楊葉多糖,3.141 3 mg/mL;Vc,5.219 6 mg/mL。結(jié)果見圖7。

2.4.2 清除ABTS+·自由基能力測(cè)定先將7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的過硫酸鉀溶液按體積比2∶1混合,室溫下避光反應(yīng)16 h,即為ABTS儲(chǔ)備液;用前以純水稀釋,使其在波長734 nm處的吸光度值D0為0.70±0.20。分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液和2 mL ABTS稀釋液于試管中,超聲30 s,室溫下暗處反應(yīng)8 min,于波長734 nm處測(cè)定吸光度值D1。根據(jù)下式計(jì)算清除率:清除率=[(D0-D1)/D0]×100%。

圖6 不同因素對(duì)楓楊葉多糖得率影響的響應(yīng)面值(1)(3)(5)與等高線圖(2)(4)(6)Figure 6 The response surface diagrams(1)(3)(5)and contour line plots(2)(4)(6)for the effects of the different factors on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖7 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)DPPH·自由基清除能力的變化(1)(2)Figure 7 The changes of DPPH· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations(1)(2)

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:楓楊葉多糖,Y=0.287 0X+0.310 7(R2=0.993 3);Vc,Y=17.384 1X+0.320 9(R2=0.994 0)。計(jì)算IC50得:楓楊葉多糖,0.659 6 mg/mL;Vc,0.010 30 mg/mL。結(jié)果見圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)ABTS+·自由基清除能力的變化(1)(2)Figure 8 The changes of ABTS+· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations(1)(2)

2.4.3 清除·OH自由基能力測(cè)定 分別吸取2 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液、2 mL的6 mmol/L FeSO4溶液及2 mL的6 mmol/L H2O2溶液于試管中,靜置10 min后再加入2 mL的6 mmol/L水楊酸溶液,靜置30 min,于波長510 nm處測(cè)定吸光度D1值;以純水代替水楊酸,同法測(cè)定吸光度D2值;另以純水為空白對(duì)照,測(cè)定吸光度D0值。根據(jù)下式計(jì)算清除率:清除率 =[1-(D1-D2)/D0]× 100%。

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:楓楊葉多糖,Y=0.020 4X+0.271 4(R2=0.980 6);Vc,Y=1.002 7X+0.204 8(R2=0.985 3),計(jì)算IC50得:楓楊葉多糖,11.205 9 mg/mL;Vc,0.294 4 mg/mL。結(jié)果見圖9。

圖9 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)·OH自由基清除能力的變化(1)(2)Figure 9 The changes of·OH radical-scavenging activities of the samples at different concentrations(1)(2)

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:楓楊葉多糖,Y=0.934 9X+0.098 7(R2=0.980 5);Vc,Y=31.931 0X+0.190 4(R2=0.983 0)。計(jì)算IC50得:楓楊葉多糖,0.429 2 mg/mL;Vc,0.009 314 mg/mL。結(jié)果見圖10。

圖10 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)O-2自由基清除能力的變化(1)(2)Figure 10 The changes of O-2 radical-scavenging activities of the samples at different concentrations(1)(2)

2.4.5 還原力測(cè)定 分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于試管中,依次加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液(pH=6.6)各2.5 mL,混勻,50℃水浴20 min,取出冰水冷卻至室溫。再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,混勻,3 000 r/min離心10 min;取上清液2.5 mL,加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL的蒸餾水,混勻20 min后于波長700 nm處測(cè)其吸光度。同時(shí)以水為空白溶劑、Vc為陽性對(duì)照。由圖11可知,楓楊葉多糖與Vc的還原力均隨質(zhì)量濃度的增大而較為緩慢提高。二者相比,Vc的還原力更強(qiáng)。

圖11 不同樣品的還原能力Figure 11 The reducing power of the different samples

3 討論

本研究通過響應(yīng)面法篩選出楓楊葉多糖的最優(yōu)提取工藝為:乙醇60%、料液比1∶40、100℃加熱回流提取3.5 h、提取2次。驗(yàn)證結(jié)果顯示多糖得率為12.12%。表明所建立的模型具有良好的預(yù)測(cè)性。同時(shí)分析因素間的交互效應(yīng)發(fā)現(xiàn),乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間的相互影響較為明顯。

抗氧化活性結(jié)果表明,楓楊葉多糖對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH和等自由基的清除能力較強(qiáng),還原力與抗氧化能力表現(xiàn)出正相關(guān)性,且均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系,其中對(duì)DPPH·的IC50(3.141 3 mg/mL)明顯低于Vc的IC50(5.219 6 mg/mL)。提示楓楊葉多糖具有較好的抗氧化作用,可用于醫(yī)藥保健食品、美容護(hù)膚品等產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。由于所得楓楊葉多糖仍為粗品,純度較低,我們將在下一步工作中對(duì)其進(jìn)行分離、純化,制備出純度更高的多糖物質(zhì),同時(shí)將會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化試驗(yàn),以更好地確證其抗氧化功能。

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