王詩敏，孫素靜，紀一倫

1.西安市第四醫(yī)院兒科，西安 710000 2.西安市第四醫(yī)院兒童保健科，西安 710000

哮喘是兒童常見的疾病，全球目前約有2.35億哮喘患者，350萬兒童至少有1次哮喘發(fā)作[1-2]。為了有效地治療哮喘，探究其病因及發(fā)病的分子機制十分重要。環(huán)境因素在哮喘發(fā)作風險中起重要作用，如空氣污染[3]?？諝馕廴究蓪?dǎo)致肺功能降低、咳嗽、鼻部疾病、哮喘發(fā)作、鼻黏膜炎癥和皮疹等，所有這些都可能與哮喘有關(guān)。雖然與交通相關(guān)的空氣污染可加重呼吸系統(tǒng)疾病，并誘導(dǎo)現(xiàn)有哮喘發(fā)作。但是，兒童在室內(nèi)的時間更多，因此研究室內(nèi)空氣污染對其哮喘發(fā)作的影響至關(guān)重要[4]。

暴露在空氣中的污染物，如CO、NO2、SO2、PM10和PM2.5在哮喘發(fā)作中起重要作用[5]。miR-155是研究最多的miRNA之一，與復(fù)雜的細胞活動有關(guān)。變態(tài)反應(yīng)常由高活性的CD4+輔助性T細胞2(Th2)引起，而miR-155在調(diào)節(jié)過敏性哮喘的細胞免疫活性中起重要作用[6]。本研究旨在探討血清miR-155的變化與空氣污染性哮喘的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2017年9月至2019年3月在西安市多家醫(yī)院就診的176例哮喘患兒(哮喘組)及進行體檢的176名健康兒童(對照組)進行國際兒童哮喘和過敏研究(the international study of asthma and allergies in childhood，ISAAC)問卷調(diào)查。所有受試對象有身份證或戶口本，如漢族、回族等民族信息均可以通過相關(guān)證件進行區(qū)分。本次研究所有程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。問卷由兒童的父母或監(jiān)護人填寫，問卷回收率為100%，所有數(shù)據(jù)均由本院2名專業(yè)醫(yī)師進行核實。調(diào)查問題包括：過敏史、呼吸道癥狀、家族遺傳信息、生活環(huán)境、生活習慣等。哮喘的嚴重程度通過肺功能測試(pulmonary function tests，PFTS)來評估[7]。所有兒童的父母或監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 哮喘納入標準：(1)哮喘和室內(nèi)空氣污染史同時存在；(2)存在氣流阻塞(連續(xù)3 d或3 d以上咳嗽、喘息和呼吸困難，發(fā)生2次或2次以上；(3)β受體激動劑吸入后，第1秒用力呼氣容積(FEV1)增加15%；(4)本實驗之前，持續(xù)性哮喘至少發(fā)生3個月。排除標準：(1)哮喘發(fā)生3個月內(nèi)使用維生素和(或)抗生素進行治療；(2)有嚴重的器官衰竭，嚴重的心臟、腎臟等疾病。

1.3 miR-155檢測 每名受試者抽取5 mL靜脈血，置于含有2%乙二胺四乙酸抗凝劑的一次性試管中，并充分混合，在4℃下以1 500 r/min離心15 min，收集血清，存儲于-80℃。采用RT-PCR法定量檢測血清miR-155。用microRNA分析試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。用5 μL RNA提取液、0.2 μL 100 mmol/L dNTPs、1.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)、2 μL 10×緩沖液、0.2 μL RNA酶抑制劑(20 U/μL)、0.5 μL引物(20 μm，正向引物：5′-GCG GTT AAT GTA ATC GTG AT-3′，反向引物：5′-GTG CGG GCG AGG T-3′)和9.6 μL雙蒸水在20 μL反應(yīng)體系下進行反應(yīng)。將預(yù)混物在16 ℃下反應(yīng)30 min，42 ℃反應(yīng)30 min，90 ℃反應(yīng)5 min。另外，用12 μL預(yù)混物、1.2 μL引物和6.8 μL無RNA的雙蒸水擴增5 μL cDNA溶液(最終共25 μL)。在7500實時PCR系統(tǒng)(美國賽默費希爾科學公司)上進行qPCR，在94 ℃下反應(yīng)5 min，進行45個循環(huán)(共10 s)，在66 ℃下反應(yīng)45 s。根據(jù)ΔΔCT法計算U6 核小RNA(正向引物：5′-CTC GCT CGC AGC CA-3′；反向引物，5′-AAC GCT TCA ATT TGC GT-3′)與miR-155的相對水平。

1.4 室內(nèi)空氣采集及質(zhì)量分析 根據(jù)中國《室內(nèi)空氣質(zhì)量標準》(GB/T1883-2002)進行采樣，采樣點應(yīng)高出地面1.0～1.5 m，所有門窗在采樣前關(guān)閉12 h[8]。根據(jù)ISO 10012-1和ISO 14644以及美國聯(lián)邦標準209[9]，用手持粒子計數(shù)器(美國Lighthouse 3016IAQ)測量室內(nèi)粒子(PM10、PM2.5和PM1)濃度。

從起居室和臥室采集多個顆粒樣品，采樣率設(shè)定為2.83 L/min，家庭成員正常生活期間，從周一至周五19:00至20:00每天采樣1 h。采用大氣采樣器(北京國際環(huán)境衛(wèi)生研究所環(huán)境保護研究所)采集甲醛(HCHO)和NO2樣品，采用N-(1-萘基)-乙二胺二氫氯化物分光光度法測定。同時對客廳和臥室的空氣污染物進行測量，測量時間為2個月。

2 結(jié) 果

2.1 兩組兒童基本資料的比較 結(jié)果(表1)表明：兩組兒童性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)指數(shù)、民族分布差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 兩組兒童血清miR-155水平的比較 從500 μL血清中分離得到總RNA的0.05～0.29 μg/μL。結(jié)果(圖1)顯示：哮喘組的血清miR-155水平為((7.61±2.47)μg/μL，大于對照組[3.31±1.24)μg/μL]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表1 兩組兒童基本資料的比較 N=176

圖1 兩組兒童血清中miR-155水平

2.3 兩組室內(nèi)空氣污染物比較 結(jié)果(表2)表明：哮喘組室內(nèi)PM10、PM2.5、PM1、HCHO、NO2濃度均高于對照組(P<0.05)。

表2 兩組室內(nèi)空氣污染物的比較 N=176；M(P25,P75)

HCHO：甲醛

2.4 兩組哮喘其他危險因素比較 單因素分析(表3)顯示：兩組兒童過敏史、母乳喂養(yǎng)、環(huán)境煙草煙霧 (environmental tobacco smoke,ETS)暴露、室內(nèi)植物比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，鼻炎史無差異。

表3 兩組兒童哮喘相關(guān)病史及環(huán)境因素比較 N=176，n(%)

ETS：環(huán)境煙草煙霧

2.5 兒童哮喘危險因素的logistic多因素回歸分析 將上述有差異的危險因素納入logistic多因素回歸分析，結(jié)果(表4)顯示：兒童過敏史、母乳喂養(yǎng)、ETS、PM2.5、HCHO與哮喘發(fā)作相關(guān)(P<0.05)，其中母乳喂養(yǎng)對兒童哮喘有保護作用。

表4 兒童哮喘危險因素的logistic多因素回歸分析 N=176

ETS：環(huán)境煙草煙霧；HCHO：甲醛

2.6 血清miR-155水平與兒童哮喘危險因素的相關(guān)性分析 結(jié)果(表5)顯示：哮喘組血清miR-155水平與兒童過敏史、母乳喂養(yǎng)、ETS、PM2.5、HCHO均相關(guān)(P<0.05)；對照組無此相關(guān)性。

表5 血清miR-155水平與兒童哮喘因素的相關(guān)性 N=176

ETS：環(huán)境煙草煙霧；HCHO：甲醛

3 討 論

空氣污染物加重了兒童哮喘癥狀的嚴重程度?？諝馕廴局械念w粒物與兒童呼出的高濃度NO2有關(guān)；柴油廢氣顆粒和汽車排放的NO2會降低兒童血液的酸堿度，而較低的酸堿度可引起氣道炎癥[10]。研究[11]報道，肺泡液中較低的酸堿度和較高水平的表皮生長因子可導(dǎo)致哮喘患者發(fā)生全身炎癥。多環(huán)芳烴是大氣污染的主要成分，超過30%的多環(huán)芳烴可被人體吸入[12]。多環(huán)芳烴能破壞抗氧化防御系統(tǒng)，間接導(dǎo)致兒童哮喘的發(fā)作。此外，控制空氣污染引起的氧化應(yīng)激和防止呼吸器官損傷可減少兒童哮喘的發(fā)作。

本研究顯示，西安市哮喘兒童家庭室內(nèi)PM10、PM2.5、PM1、HCHO和NO2均較高，可能與汽車尾氣排放和工業(yè)發(fā)展有關(guān)。在中國，烹飪和吸煙是與室內(nèi)PM2.5的主要來源。其中，使用煤炭的家庭室內(nèi)顆粒物比較高，而使用燃氣或電做飯可使PM2.5降低40%～70%[13]。PM2.5常在公共室內(nèi)場所(如吸煙休息室)被檢測到，主要含有苯并芘、多環(huán)芳烴和鄰苯二甲酸酯等[14]。一般認為，室內(nèi)吸煙、烹飪、ETS和家庭裝飾增加了室內(nèi)顆粒物的濃度，使兒童哮喘的發(fā)生風險增加。

本研究logistic多因素回歸分析顯示，室內(nèi)PM2.5暴露是兒童哮喘發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。HCHO是主要的室內(nèi)空氣污染物之一，具有強烈的刺激性氣味。本研究表明，HCHO也是兒童哮喘發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。母乳含有大量的IgA、細胞因子、長鏈脂肪酸和低聚糖等物質(zhì)，可以改善嬰兒的免疫狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)是避免兒童哮喘發(fā)作的一個保護因素(P<0.05)。

miR-155在哺乳動物呼吸系統(tǒng)中表達較廣泛，是通過降低Th2來調(diào)節(jié)炎癥活性的潛在治療靶點，且在哮喘進展中起重要作用[6]。microRNA檢測是診斷小兒哮喘的一種簡單、無創(chuàng)的方法。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可能與兒童哮喘的風險增加有關(guān)。本研究為兒童哮喘的基因治療和環(huán)境因素控制提供了理論依據(jù)，但還需要進一步的工作來證實。

本研究存在的局限性：未能分析miR-155與兒童哮喘關(guān)系的相關(guān)分子機制；同時未能分析空氣污染通過影響血清miR-155水平誘發(fā)哮喘的分子機制；未分析室內(nèi)污染物產(chǎn)生的原因。與吸煙相比，烹飪可能是增加室內(nèi)顆粒物的主要因素。今后還需要進一步的研究來深入探討上述問題。

綜上所述，室內(nèi)空氣污染與西安市兒童哮喘的發(fā)生有關(guān)，并使其血清miR-155水平升高；哮喘患兒血清miR-155水平與室內(nèi)PM2.5和HCHO水平密切相關(guān)。因此，血清miR-155水平可能成為判斷哮喘的潛在指標。