王 暉，徐曉敏，羅騰麗，吉萬全，張 宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

小麥白粉病是小麥生長中后期的主要病害之一，由禾本科布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf. sp.tritici,Bgt)侵染所引起，導(dǎo)致小麥(Triticumaestivum)葉綠素降解，光合速率降低，產(chǎn)量受損[1]。實(shí)踐證明，利用抗病品種無疑是防控白粉病危害最經(jīng)濟(jì)、便利的方法。目前，在小麥中已經(jīng)有64個(gè)抗白粉病基因被正式命名[2]。但是，多數(shù)品種攜帶的抗性基因(resistance gene,R)為專一抗性基因，其抗病譜窄，面對(duì)變異頻繁的病菌，其抗性容易喪失。因此，育種實(shí)踐中，對(duì)抗病基因，尤其是廣譜抗性基因的需求和研究顯得更加迫切[3-4]。

在長期的協(xié)同進(jìn)化中，植物對(duì)大多數(shù)的微生物入侵產(chǎn)生了免疫力[5-6]。其中非寄主抗性是植物對(duì)大多數(shù)病原微生物最普遍的抗病形式之一，且具有廣譜持久的特性。植物的先天免疫系統(tǒng)包括兩種反應(yīng)模式，一個(gè)是被模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別的病原物表面分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)所觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity,PTI)[7]；另一個(gè)是由NB-LRR蛋白識(shí)別效應(yīng)因子所啟動(dòng)的免疫反應(yīng)(Effector-triggered immunity,ETI)[8]。無論是PTI還是ETI在植物抗病方面所起到的作用都需要復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，涉及到各種植物激素的調(diào)節(jié)。其中，水楊酸(saliculic acid,SA)調(diào)節(jié)的信號(hào)通路在多個(gè)非寄主抗性反應(yīng)中扮演著重要的角色，如擬南芥防御柑橘潰瘍病菌[9]、水稻(轉(zhuǎn)玉米非寄主抗性基因Rxo1)抵抗細(xì)菌性條斑病反應(yīng)[10]等。值得注意的是，類似于抗病基因PR1和PAD4[11]，寄主響應(yīng)細(xì)菌和真菌病原體等非寄生菌脅迫過程中，NHO1基因亦是植物非寄主抗性病程中必需和共有的[12]。如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，NHO1基因有助于抵抗真菌灰葡萄胞菌(Botrytiscinere)和細(xì)菌丁香假單胞菌(PseudomonassyringaetabaciP.s.tabaci)的侵染[13-14]。與此同時(shí)，NHO1基因也參與部分抗性基因所介導(dǎo)的寄主抗性，如RPM1、RPS2等[12,15]。除模式植物外，水稻(Oryzasativa)OsNHO1基因[16]和莧色蔾(Chenopodiumamaranticolor)CaNHO1基因[15]同樣也被證實(shí)在相應(yīng)的非寄主和寄主抗性中發(fā)揮著重要作用。正是由此，Peart等[17]認(rèn)為非寄主抗性與寄主抗性機(jī)制之間存在一定的相關(guān)性。由此可見，NHO1基因在廣譜抗性方面具有廣泛的功能和廣闊的利用前景。然而，目前對(duì)植物非寄主抗性分子機(jī)制的研究依然十分有限。

擬南芥NHO1基因編碼的甘油激酶(glycerol kinase,GK)，是甘油代謝的限速酶[18]；同時(shí)也是能量代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)脂肪的儲(chǔ)存和碳水化合物的代謝起著至關(guān)重要的作用[19]。甘油激酶催化甘油產(chǎn)生的3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate, G3P)，是擬南芥基礎(chǔ)抗性和系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)中植物防御信號(hào)的一種新型調(diào)控因子[14,20]。Yang等[21]報(bào)道小麥中NHO1基因通過參與調(diào)控G3P的合成來影響對(duì)小麥條銹菌(PucciniastriiformisWestend f. sp.triticiErikss,Pst)的抗性，同時(shí)證實(shí)該基因參與了SA通路對(duì)無毒Pst小種CYR23的應(yīng)答，但對(duì)于響應(yīng)小麥白粉菌侵染過程中該基因的表達(dá)差異，以及對(duì)該基因的啟動(dòng)子研究以及亞細(xì)胞定位等未見報(bào)導(dǎo)。因此在小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上[22]，本研究克隆了小麥中位于A、B、D三個(gè)基因組中的NHO1基因的部分同源序列，通過對(duì)其在小麥白粉菌脅迫下，三個(gè)部分同源染色體基因各自時(shí)空表達(dá)模式、啟動(dòng)子區(qū)域序列上調(diào)控元件及亞細(xì)胞定位進(jìn)行初步分析，以期對(duì)該基因在小麥抗白粉病過程中的功能進(jìn)行進(jìn)一步解析。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

小麥條銹病和白粉病兼抗種質(zhì)N9134是以染色體工具材料“阿勃5B非整倍體”為母本，與野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)As846雜交后代經(jīng)抗性定向選擇而來的農(nóng)藝性狀良好且抗白粉病的小麥新種質(zhì)。陜優(yōu)225為本實(shí)驗(yàn)小麥白粉菌繁殖寄主和接種感病對(duì)照。以N9134為供體，陜優(yōu)225 為輪回親本，經(jīng)7輪回交培育的攜帶PmAs846抗/感病近等基因系N9134R和N9134S由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院培育并保存。中國春(China spring,CS)及中國春缺體-四體N2BT2A、N2DT2B、雙端體DT2AS、陜優(yōu)225和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)的種子均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

小麥白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.triticiBgt)E09菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類病害創(chuàng)新課題組惠贈(zèng)。

1.2 材料的處理

將N9134及其抗病近等基因系N9134R、感病近等基因系N9134S種于盆缽中，置于25 ℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待幼苗長到兩葉一心時(shí)，通過抖接法接種E09菌株。分別于接種前0 h，接種后12、24、36、48、72 h取葉樣，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA、總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用CTAB法[23]提取小麥葉片基因組DNA。采用Trizol試劑法[24]對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)葉片樣品進(jìn)行總RNA的提取。再根據(jù)PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)試劑盒程序進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.4 目的基因CDS區(qū)序列克隆及定位

利用Zhang 等[22]N9134 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)結(jié)合基因組測(cè)序結(jié)果，依據(jù)獲得序列中最大開放閱讀框設(shè)計(jì)引物(表1)。以引物TaNHO1-F/R 、TaNHO1-2BF/R、 TaNHO1-2DF/R在cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增并采用缺體-四體定位，以特異性引物在DNA中擴(kuò)增，來明確該基因所在染色體位置。PCR反應(yīng)體系及程序參照吳迪等[25]方法。

1.5 生物信息學(xué)分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Tools)中BLAST程序?qū)aNHO1基因進(jìn)行核酸序列及其氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；用ExPASy(https://www.expasy.org/resources)中的在線網(wǎng)站資源進(jìn)行生物信息學(xué)分析，如InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；用Target P1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) 、Signal P3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0)以及 TMHMMServer v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件對(duì)蛋白的信號(hào)肽、跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測(cè)； 用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)對(duì)蛋白的親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2)進(jìn)行該蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用 DNAMAN 8軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，用MEGA 7.0軟件，采取 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用MEME Suite 5.0(http://meme-suite.org)和GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)在線分析軟件對(duì)序列motif和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.6 基因啟動(dòng)子區(qū)域克隆及分析

依據(jù)Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)上公布的序列，選取ATG上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)專一引物2A、2B、2D-promter F/R(表1)在基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用方法同本文1.4內(nèi)容。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)在線對(duì)其進(jìn)行分析。

1.7 E09侵染下 TaNHO1基因的表達(dá)分析

基于克隆得到的TaNHO1同源基因序列，在其差異區(qū)域分別設(shè)計(jì)專一性引物(表1)，以TaActin為內(nèi)參基因(表1)。利用TaKaRa公司(大連)的RR037A試劑盒要求采用兩步法，對(duì)實(shí)驗(yàn)材料所取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)葉片的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過ABI 7300型熒光定量PCR儀，采用TaKaRa公司(大連) RR820A試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，利用2-△△Ct法進(jìn)行目標(biāo)基因接種白粉菌后的表達(dá)分析。

1.8 亞細(xì)胞定位

以楊凌奧科鼎盛生物科技公司測(cè)序的含有TaNHO1-2B基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)同源重組引物GFP-F和 GFP-R(表1)擴(kuò)增TaNHO1基因的CDS序列(已除終止子TAG)，方法同1.4。將擴(kuò)增得到的序列與SpeⅠ酶切的PYJ::GFP載體同源重組構(gòu)建成PYJ-TaNHO1-2B-GFP載體，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測(cè)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105， 以PYJ::GFP載體的空白載體為對(duì)照。參照丁作美[26]等的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染及觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaNHO1基因的同源克隆結(jié)果

以接種E09的N9134葉片cDNA為模板，以TaNHO1-F/R(表1)為引物，對(duì)TaNHO1-2A基因擴(kuò)增得到長度1 800 bp左右的目標(biāo)條帶 (圖1)，對(duì)該條帶進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、測(cè)序后，利用NCBI進(jìn)行核酸序列比對(duì)，結(jié)果表明，與小麥編碼甘油激酶基因相似度高達(dá)96%。利用特異性引物(表1)擴(kuò)增得到的3個(gè)同源基因(圖1)分別位于第2同源群A、B、D染色體上，故命名為TaNHO1-2A(Genbank登陸號(hào)MN082576)、TaNHO1-2B(Genbank登陸號(hào)MN082577)和TaNHO1-2D(Genbank登陸號(hào)MN082578)。CDS序列全長分別為1 605、1 599和1 605 bp。經(jīng)序列比較，3個(gè)基因中存在91個(gè)SNP差異。與基因組DNA比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，基因均含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子(圖3-B)。TaNHO1-2B在第一外顯子中比TaNHO1-2A/2D少6 bp，3條來自不同基因組序列的差異主要存在于內(nèi)含子上。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1～3分別代表TaNHO1-2A、TaNHO1-2B和TaNHO1-2D的PCR產(chǎn)物。

M:DNA Marker DL2000; 1,2 and 3 represent the PCR products ofTaNHO1-2A,TaNHO1-2BandTaNHO1-2D, respectively.

圖1TaNHO1基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1 PCR amplification ofTaNHO1gene

2.2 染色體定位結(jié)果

電泳結(jié)果(圖2)分析表明：引物TaNHO1-F/R在DT2AS雙端體中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而在N2BT2A 、N2DT2B缺體-四體以及CS中擴(kuò)增得到3 941 bp來源于A染色體組的條帶；引物TaNHO1-2B F/R在N2BT2A缺體-四體中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而在DT2AS雙端體、N2DT2B缺體-四體以及CS中擴(kuò)增得到3 930 bp來源于B染色體組的條帶；引物TaNHO1-2D F/R在N2DT2B缺體-四體中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而在DT2AS雙端體、N2BT2A缺體-四體以及CS中擴(kuò)增得到 3 762 bp來源于D染色體組的條帶。因此，進(jìn)一步明確3個(gè)同源基因轉(zhuǎn)錄自小麥第二同源群3條部分同源染色體。

M： DL5000；A、B、C為TaNHO1-2A、TaNHO1-2B和TaNHO1-2D的缺體-四體定位;1、6、11模板為N9134； 2、7、12模板為CS；3、8、13模板為DT2AS；4、9、14模板為N2BT2A；5、10、15模板為N2DT2B。

M:DL5000; A,B and C are the localization ofTaNHO1-2A,TaNHO1-2BandTaNHO1-2D,respectively.Lanes 1, 6 and 11:Amplicons from N9134; Lanes 2, 7 and 12:Amplicons from CS; lanes 3, 8 and 13:Amplicons from DT2AS;Lanes 4, 9 and 14:Amplicons from N2BT2A; lanes 5, 10 and 15:Amplicons from N2DT2B.

圖2TaNHO1同源基因的缺體-四體定位擴(kuò)增電泳

Fig.2 Localization ofTaNHO1homologous genes with nulli-tetrasomic lines

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白的理化性質(zhì)

利用Target P1.1、Signal P3.0和TMHMM 軟件進(jìn)行的分析表明，TaNHO1基因在小麥中的三個(gè)同源基因均編碼一種非分泌蛋白，無法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，為非跨膜蛋白。ProtScale在線進(jìn)行分析推測(cè)出TaNHO1基因編碼的蛋白為親水蛋白。一般來說，可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)存在于多肽鏈中越多，其所能發(fā)揮的功能就可能更多[27]。通過 NetPhos 2.0在線軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明其含有大量的蛋白磷酸化位點(diǎn)(表2)，由此推測(cè)出其編碼的蛋白質(zhì)活性可能與其磷酸化調(diào)控有關(guān)。用InterProScan對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)同源基因均含有FGGY家族成員的特征結(jié)構(gòu)域，包括參與底物結(jié)合的FGGY_N端結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)ATP結(jié)合的FGGY_C端結(jié)構(gòu)域。與擬南芥、水稻中編碼NHO1基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明其包含F(xiàn)GGY家族中2個(gè)保守位點(diǎn)和ATP結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)，推測(cè)TaNHO1編碼小麥甘油激酶。

A：NHO1基因的氨基酸序列比對(duì)，橫線部分為ATP結(jié)合位點(diǎn)，線框部分為2個(gè)FGGY家族保守位點(diǎn)；B：小麥和其他植物編碼甘油激酶蛋白之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹；用MEME4.0程序中描述的方法進(jìn)行motif分析，盒子的不同顏色代表蛋白對(duì)應(yīng)位置的10個(gè)motif；基因結(jié)構(gòu)分析，橫線為內(nèi)含子，盒子為對(duì)應(yīng)的外顯子和上下游非編碼區(qū)。

A:Amino acid sequence alignment deduced fromNHO1genes;the underlined sequence is the ATP binding site, and the boxed parts are the two conserved sites of the FGGY family; B:Consensus neighbor-joining tree based on the sequences of glycerol kinase from wheat and other plant;Motif analysis was determined by using MEME 4.0 program as described in methods. Different colors of the boxes represent 10 motifs in the corresponding position of each proteins.For gene structure analysis, the horizontal lines represent introns, the boxes correspond to exons and 5’UTR and 3’UTR.

圖3 NHO1蛋白同源性分析

Fig.3 Homology analysis of NHO1 proteins

表2 同源基因中磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)Table 2 Number of phosphorylation sites in the three alleles

2.3.2 蛋白同源性

利用NCBI中同源序列比對(duì)獲取擬南芥、水稻、野生二粒小麥、粗山羊草(Aegilopstauschii)、烏拉爾圖小麥 (Triticumurartu)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、谷子(Setariaitalica)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)以及高粱(Sorghumvulgare)等物種中與之同源性較高的基因序列。選取AtNHO1與OsNHO1基因同小麥NHO1基因進(jìn)行多序列的比對(duì)(圖3A)。發(fā)現(xiàn)TaNHO1-2A/2B/2D與AtNHO1和OsNHO1之間高度保守。為進(jìn)一步研究TaNHO1基因的進(jìn)化關(guān)系，將其與其他物種的氨基酸序列通過MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3B)，發(fā)現(xiàn)TaNHO1-2A與野生二粒小麥A染色體組(TRIDC2AG072400)親緣關(guān)系最近；TaNHO1-2B與野生二粒小麥B染色體組(TRIDC2BG078470)親緣關(guān)系最近；TaNHO1-2D與粗山羊草(EMT01355)親緣關(guān)系最近。進(jìn)化分析表明，普通小麥和野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、大麥(HORVU2Hr1G114260)、粗山羊草(EMT01355)等C3的單子葉作物屬于同分支；與高粱(EES12965)、谷子(KQK99202)、玉米(Zm00001d002085_T001)等C4的單子葉作物屬于遺傳較遠(yuǎn)的另一分支；與擬南芥AtNHO1等雙子葉植物遺傳距離最遠(yuǎn)。通過MEME 5.0對(duì)其蛋白序列進(jìn)行保守motif預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)保守motif，其中有9個(gè)motif在所有蛋白質(zhì)中存在，其排列順序也相同。通過對(duì)基因結(jié)構(gòu)的分析表明，小麥TaNHO1在基因結(jié)構(gòu)上與其他作物之間具有較大的相似性。綜合以上結(jié)果表明TaNHO1-2A、2B和2D與AtNHO1和OsNHO1以及其他作物編碼甘油激酶的基因序列之間高度保守。

2.4 啟動(dòng)子區(qū)域分析

啟動(dòng)子分析結(jié)果表明：序列中除TATA-box和CAAT-box以外還含有大量響應(yīng)植物激素以及干旱等脅迫的順式作用元件，且在同源基因間存在差異。從響應(yīng)植物激素元件來看，TaNHO1基因啟動(dòng)子受到多種植物激素調(diào)控，參與防衛(wèi)、脅迫等植物應(yīng)激反應(yīng)，推測(cè)該基因可能受多種激素信號(hào)調(diào)節(jié)并參與小麥抗病抗逆反應(yīng)，是一個(gè)與抗逆境相關(guān)的基因。從三個(gè)同源基因的啟動(dòng)子的差異上看，其均能受到SA、茉莉酸(jasmonic acid, JA)等植物激素誘導(dǎo)影響，但相同元件的數(shù)量不同(表3)且所處的位置不同(圖4)。TaNHO1-2B基因啟動(dòng)子分析結(jié)果在接受植物激素誘導(dǎo)的順式作用元件的數(shù)量上明顯多于TaNHO1-2A/2D。

2.5 侵染后的表達(dá)差異分析

該基因的3個(gè)部分同源染色體同源基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)分析(圖5)結(jié)果表明，對(duì)N9134的抗病近等基因系(N9134R)接種E09后，TaNHO1-2A、2B基因在接種早期均迅速呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，在接種12 h到24 h之內(nèi)分別達(dá)到2.8和2.3倍上調(diào)表達(dá)；TaNHO1-2A基因在24 h后趨于正常水平，但TaNHO1-2B基因在72 h的表達(dá)量再次上調(diào)；而TaNHO1-2D在36 h后先表現(xiàn)下調(diào)，但在72 h表現(xiàn)出高于對(duì)照3.5倍的上調(diào)表達(dá)。對(duì)N9131的感病近等基因系(N9134S)接種E09后，該基因在3個(gè)部分同源染色體的同源基因均在接種48 h表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)。雖然同源基因TaNHO1在表達(dá)模式和表達(dá)量上存在差異，但均在小麥響應(yīng)白粉菌侵染時(shí)參與了防御反應(yīng)，且在其在抗、感病近等基因系之間的表達(dá)量上存在明顯差異。

2.6 蛋白亞細(xì)胞定位

利用Cell-PLoc2.0的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白作用于細(xì)胞質(zhì)上的可能性最大，其次是細(xì)胞膜、細(xì)胞核上。為了更加準(zhǔn)確的定位該蛋白的作用位置，進(jìn)行了亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，PYJ::GFP空白載體分布在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)等部位(圖6A)，而PYJ-TaNHO1-2B-GFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜以及核膜中表達(dá)(圖6B)，這說明該基因定位結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

表3 TaNHO1-2A、2B、2D啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件Table 3 Main cis-acting elements of TaNHO1-2A, 2Band 2Dpromoter regions

圖4 TaNHO1啟動(dòng)子區(qū)部分順勢(shì)作用元件的相對(duì)位置

A:對(duì)N9134R接種E09后TaNHO1-2A/2B/2D基因的相對(duì)表達(dá)量； B：對(duì)N9134S接種E09后TaNHO1-2A/2B/2D基因的相對(duì)表達(dá)量。

A:Relative transcriptional changes ofTaNHO1-2A/2B/2Dinduced byBgtinfection in N9134R after inoculation with E09; B:Relative transcriptional changes ofTaNHO1-2A/2B/2Dinduced byBgtinfection in N9134S after inoculation with E09.

圖5TaNHO1基因在E09侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量

Fig.5 Relative expression levels ofTaNHO1gene at different time points after infection

A:對(duì)照PYJ::GFP空白載體定位；B:PYJ-TaNHO1-2B-GFP融合蛋白定位。

A:The localization of control PYJ::GFP empty vector; B:The localization of PYJ-TaNHO1-2B-GFP fusion protein.

圖6 小麥TaNHO1-2B基因的亞細(xì)胞定位分析

Fig.6 Subcellular localization of wheatTaNHO1-2Bgene

3 討 論

前人研究表明，NHO1基因編碼的甘油激酶參與甘油代謝合成G3P，而在擬南芥中G3P是其基礎(chǔ)抗性和系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)防御系統(tǒng)中的一種新型調(diào)控因子[13,20]。水稻OsNHO1通過上游SA信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)其本身寄主病原物PXO99的抗性[16]。此外，將水稻OsNHO1互補(bǔ)到擬南芥nho1突變體上，證明其可以恢復(fù)對(duì)非寄主病原物的抗性。我們對(duì)TaNHO1-2A、2B和2D基因的啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)均含有大量TCA-element、as-I等元件，意味著SA可能調(diào)控TaNHO1-2A、2B和2D基因的表達(dá)。這一結(jié)果進(jìn)一步為SA信號(hào)通路和NHO1基因均響應(yīng)小麥抗條銹病[21]的過程提供了理論解釋。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，PCR擴(kuò)增得到的小麥TaNHO1基因的三個(gè)同源基因，其編碼蛋白均屬于FGGY家族，含有FGGY_C端結(jié)構(gòu)域和FGGY_N端結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥、水稻、紅藻(Pyropiahaitanensis)、莧色蔾(Chenopodiumamaranticdor)乃至大腸桿菌(Escherichiacoli)編碼甘油激酶的基因具有相同的保守結(jié)構(gòu)域；利用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹、以及通過分析保守motif和比較不同作物間同源基因的基因結(jié)構(gòu)得到的結(jié)果表明該基因在進(jìn)化過程中高度保守。在轉(zhuǎn)錄水平，Pseudonmonassyringaepv. Phaseolicola侵染擬南芥時(shí)，AtNHO1基因在12 h到24 h之間轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)來響應(yīng)非寄主病原菌的侵染[28]；在水稻被白葉枯病原菌PXO99侵染時(shí)，OsNHO1基因在9 h到24 h之間表現(xiàn)出強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá)來抵抗寄主病原菌侵染[16]。與此同時(shí)，在小麥抵抗Pst無毒性小種CYR23侵染中，TaGLI/NHO1基因同樣的在12 h到24 h上調(diào)表達(dá)后趨于正常值[21]，這與本實(shí)驗(yàn)得到的TaNHO1-2A基因在響應(yīng)Bgt無毒小種侵染時(shí)的表達(dá)模式相同，且基因啟動(dòng)子區(qū)域與OsNHO1基因啟動(dòng)子較為相似，均含有大量的植物激素響應(yīng)元件，如MeJA順式作用元件、TGA-element、ABRE、MBS等。綜合以上結(jié)果，TaNHO1基因在結(jié)構(gòu)上與響應(yīng)病原菌侵染過程中同AtNHO1和OsNHO1擁有高度的相似性。序列相似意味著功能相近，因此推測(cè)其在小麥非寄主抗性方面可能發(fā)揮著類似的作用。

據(jù)報(bào)道，甘油激酶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)催化ATP中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到甘油中，從而產(chǎn)生G3P；而在微生物中甘油激酶可以與結(jié)合在細(xì)胞膜上的甘油促進(jìn)子相互作用并可以促進(jìn)甘油激酶的功能[29-30]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NHO激酶的多重功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，在小麥中甘油激酶主要作用在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)催化甘油向G3P轉(zhuǎn)化，改變植物甘油的含量，從而直接或者間接影響病原菌在植物中獲取的營養(yǎng)成分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)非寄主抗性[31]。此外，細(xì)胞膜和核膜定位信號(hào)結(jié)果表明，甘油激酶在植物中亦可能通過與作用于細(xì)胞膜上類似甘油促進(jìn)子的基因發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)胞內(nèi)甘油轉(zhuǎn)化成G3P，然而其互作蛋白需要進(jìn)一步研究。

多倍體化和基因冗余給小麥基因功能研究帶來了巨大阻力。本研究克隆的NHO1基因，雖然來自于3條部分同源染色體，但同源基因間對(duì)生物脅迫的反應(yīng)卻不相同，表明其都參與到響應(yīng)白粉菌侵染的過程中。在啟動(dòng)子研究報(bào)道中，啟動(dòng)子同樣存在累積效應(yīng)，同時(shí)，元件數(shù)量與轉(zhuǎn)錄距離的差異均會(huì)對(duì)啟動(dòng)子響應(yīng)的強(qiáng)度和誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果表現(xiàn)出不同的影響[32-33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)TaNHO1基因啟動(dòng)子的分析表明，雖然啟動(dòng)子的組成元件種類一致，但其在數(shù)量以及與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離不同，可能導(dǎo)致了小麥TaNHO1基因在不同染色體上的表達(dá)差異。本研究所得到的結(jié)果為進(jìn)一步解析非寄主抗性基因NHO1在小麥抗白粉病過程中的作用提供數(shù)據(jù)支撐，以及應(yīng)對(duì)小麥多倍體化，同源基因的不同表達(dá)模式分析提供了參考，同時(shí)也為小麥抗病育種提供了基因資源，此后可進(jìn)一步將TaNHO1基因轉(zhuǎn)入擬南芥nho1突變體中進(jìn)行其功能驗(yàn)證。