吳健鋒

（中山大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510080）

1 概述

膿毒癥（sepsis）是宿主對感染反應失調導致危及生命的器官功能障礙，是現(xiàn)代醫(yī)療條件下重癥病人主要的死亡原因之一［1］。由于膿毒癥的高發(fā)病率、高病死率、高治療費用的挑戰(zhàn)，全球發(fā)起了拯救膿毒癥的運動，并制定更新了治療指南［2-4］。2017年WHO將膿毒癥確定為全球衛(wèi)生優(yōu)先事項，敦促各國降低膿毒癥的全球負擔［5］。膿毒癥發(fā)病機制未明，宿主在膿毒癥發(fā)生后的免疫功能抑制是影響預后的重要原因。免疫抑制導致患者無法抵抗原發(fā)性細菌感染和容易發(fā)生繼發(fā)感染，院內病死率增加［6-8］，與再入院率和長期病死率密切相關［9-10］。因此膿毒癥誘導的免疫抑制已成為目前的研究熱點［6，11-13］。

2 膿毒癥免疫抑制的監(jiān)測

因為膿毒癥具有很大的異質性［14］，目前尚沒有膿毒癥免疫抑制的統(tǒng)一診斷標準，可以通過臨床早期識別免疫抑制的高?；颊卟⒓訌娒庖吖δ鼙O(jiān)測指導臨床治療［15］。

2.1 篩查高危人群

研究顯示具有以下特點的患者是膿毒癥相關免疫抑制的高發(fā)人群：①高齡、持續(xù)營養(yǎng)不良、長期服用免疫抑制藥物或嚴重慢性疾病如慢性腎衰、慢性肝衰、腫瘤等患者是免疫抑制的高危人群；②免疫抑制患者更易發(fā)生一些條件致病菌或者低毒性菌感染，如不動桿菌屬，單胞菌屬或真菌［15］。

2.2 監(jiān)測天然免疫功能受損判斷膿毒癥免疫抑制

2.2.1 中性粒細胞 中性粒細胞是天然免疫中十分重要的免疫細胞之一。機體受到病原微生物入侵時，中性粒細胞是感染早期最先發(fā)揮作用的免疫細胞。臨床上發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的中性粒細胞數(shù)目并不減少，甚至增多，但是未成熟的性粒細胞（CD10dim CD16dim）的比例顯著增加［16］。可以使用中性粒細胞化學發(fā)光強度的方法評判中性粒細胞的殺菌活性，膿毒癥患者的中性粒細胞化學放光強度明顯降低，提示其殺菌活性的降低［17］。因此，通過檢測中性粒細胞的表型改變和殺菌活性有助于識別膿毒癥患者是否發(fā)生免疫抑制。

2.2.2 單核細胞 人類白細胞抗原（human leuko?cyte antigen-DR，HLA-DR）是抗原提呈細胞表面表達的MHC-Ⅱ類分子，目前許多研究都已經證實單核細胞表面HLA-DR（mHLA-DR）可以用來評判膿毒癥患者免疫抑制的生物標志物，是目前監(jiān)測膿毒癥患者是否發(fā)生免疫抑制最重要的指標之一［11］。膿毒癥患者mHLA-DR低表達與膿毒癥患者的高病死率和繼發(fā)感染息息相關，早期動態(tài)的監(jiān)測mHLA-DR的變化有利于我們更及時的發(fā)現(xiàn)免疫抑制。進入ICU時間超過7 d的膿毒癥病人發(fā)生繼發(fā)感染的風險與mHLA-DR恢復速度密切相關，mHLA-DR恢復越慢，發(fā)生繼發(fā)感染的風險越高［18］。膿毒性休克的患者發(fā)生院內感染病人mHLA-DR的表達均低于未發(fā)生院內感染患者，mHLA-DR的持續(xù)低表達與院內感染的發(fā)生密切相關。本課題組研究發(fā)現(xiàn)mHLA-DR表達是否可以在3～7 d內恢復到一定程度可以準確預判患者的預后［19］。mHLA-DR的表達還可以篩選膿毒癥免疫抑制的患者并指導膿毒癥的免疫治療。Meisel等［20］研究采用GM-CSF作為免疫增強藥物治療膿毒癥免疫抑制的患者，將mHLA-DR的表達量連續(xù)兩天低于8000AB/C作為免疫抑制入組的標準，并把mHLA-DR≥15000AB/C作為治療目標。

提取膿毒癥患者外周血的單核細胞在體外用LPS刺激后檢測其釋放的細胞因子也有助于識別患者是否有免疫抑制。有研究證實膿毒癥患者單核細胞在LPS刺激后，促炎因子TNF-α和IL-12的釋放明顯減少，而促進免疫抑制的IL-10釋放明顯增多［21-22］。臨床研究中也采用這種方法驗證膿毒癥患者經過免疫刺激治療后是否改善了免疫功能［20，23］。

共抑制分子（PD-L1）在單核細胞表達增加也可以作為免疫抑制的標志物［24］。PD-1/PD-L1通路是目前免疫抑制中十分重要的通路之一，而免疫抑制患者體內免疫細胞表面PD-1和PD-L1的表達顯著增高。膿毒癥患者發(fā)病后的3～4 d就已經出現(xiàn)單核細胞表面PD-L1表達的升高［24］，并且PD-1和PD-L1的表達升高與膿毒癥的病死率、繼發(fā)感染發(fā)生率呈正相關。

2.2.3 樹突狀細胞 樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是人體最主要的抗原提呈細胞。膿毒癥患者第1天，外周循環(huán)中髓樣DC（mDC）和漿細胞樣DC（pDC）計數(shù)均明顯低于健康對照。同時，與健康對照相比，膿毒性休克患者mDC和pDC表面的HLA-DR表達也均出現(xiàn)降低［25］。該研究中的43例患者中有10例發(fā)生了繼發(fā)感染，mDC在第7天的計數(shù)在沒有繼發(fā)感染的患者中增加，而在隨后發(fā)生繼發(fā)感染的患者中仍然較低［26］。因此，動態(tài)的監(jiān)測DCs細胞亞群的數(shù)目和功能也有助于識別免疫抑制。

2.2.4 NK細胞 NK細胞作為天然免疫的重要組成部分，NK細胞的計數(shù)在膿毒癥患者會出現(xiàn)明顯的下降，而NK細胞在淋巴細胞中占比較高的患者則會有較好的預后，同時膿毒癥患者中提取的NK細胞分泌IFN-γ的能力顯著受損［27］。

2.3 監(jiān)測獲得性免疫功能受損判斷膿毒癥免疫抑制

2.3.1 淋巴細胞 淋巴細胞計數(shù)是臨床上很容易獲得的一個指標，而持續(xù)的淋巴細胞數(shù)目減少也可以作為識別免疫抑制的生物標志物。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)［28］，膿毒癥在感染后第4天，幸存者組的淋巴細胞計數(shù)明顯高于非幸存者，嚴重的淋巴細胞減少（≤0.6×109/L）與繼發(fā)感染的發(fā)生存在相關性，淋巴細胞減少是影響患者預后的獨立危險因素。目前已經有臨床研究將淋巴細胞計數(shù)小于900/mm3作為篩選免疫功能抑制病人的指標（NCT02797431、NCT02640807）。近期一項樣本量近10萬的大樣本數(shù)據(jù)［29］顯示淋巴細胞減少癥與人群感染住院的風險增加以及感染相關死亡的風險增加有關。因此，淋巴細胞計數(shù)減少可以作為的簡單易行的篩查膿毒癥免疫抑制的方法。

2.3.2 T淋巴細胞 T淋巴細胞耗竭是造成免疫功能障礙的重要原因之一。而引起T淋巴細胞減少甚至耗竭的主要原因是源于細胞凋亡。對膿毒癥患者的尸體解剖研究［8］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者脾臟內的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞顯著減少，由T淋巴細胞分泌的IFNγ和TNFα也明顯的低于非膿毒癥患者。同時，死于膿毒癥的患者體內CD4+T淋巴細胞表面存在PD-1的表達升高，相應的在巨噬細胞和內皮細胞表面也出現(xiàn)了PDL1的表達升高和HLA-DR的表達下降。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）與CD28共同享有B7分子配體，而CTLA-4與B7分子結合后誘導T細胞無反應性，參與免疫反應的負調節(jié)，膿毒癥患者CD4+和CD8+表面CTLA-4的表達會明顯增加［30-31］。這些征象證實膿毒癥患者在死亡前處在嚴重的T淋巴細胞耗竭和免疫抑制狀態(tài)。在膿毒癥中，T淋巴細胞的耗竭主要是CD4+T細胞和CD8+T細胞減少，而調節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)目并沒有減少，反而因為T淋巴細胞總數(shù)減少而造成比例增加。Treg細胞是一種抑制輔助性T細胞增殖和發(fā)揮免疫功能的T淋巴細胞亞型。目前，臨床上常使用CD4+CD25+CD127-進行Treg細胞標記。在正常情況下Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的比例是5%～10%。一項對比膿毒癥和全身炎癥反應綜合征的患者Treg細胞的研究［32］發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥早期患者體內Treg細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于對照組。T淋巴細胞耗竭和Treg細胞比例升高有助于識別免疫抑制患者。

2.3.3 B淋巴細胞 近年來，B細胞在膿毒癥的炎免疫抑制中的潛在作用受到廣泛關注。有研究［33-34］發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者早期即出現(xiàn)B細胞數(shù)目減少和耗竭，細胞凋亡是造成膿毒癥患者體內B細胞數(shù)量減少的主要原因。并且不同亞型的B淋巴細胞也存在差異，其中記憶性B淋巴細胞凋亡要高于其他的類型。除了患者的B淋巴細胞數(shù)量減少，B淋巴細胞表面MHC-II表達降低，IL-10的分泌增加［33］。因此，B淋巴細胞數(shù)目減少和功能下降有助于識別膿毒癥免疫抑制。

3 免疫增強治療

嚴重的免疫抑制是造成膿毒癥患者高病死率的主要原因之一。因此，我們可以通過上述辦法評估膿毒癥患者是否存在天然免疫和/或獲得性免疫功能障礙來識別存在免疫抑制的高危患者，進而進行針對性的免疫調理治療。

3.1 天然免疫增強的治療

3.1.1 干擾素γ 干擾素γ（IFN-γ）是一種具有多種免疫功能的細胞因子。在體內，IFN-γ可以上調病原識別受體進而有利于抗原呈遞細胞完成抗原信息的呈遞，逆轉膿毒癥患者單核細胞的HLA-DR的表達降低。1997年一項納入9例膿毒癥患者的研究［23］發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以通過刺激免疫細胞生成TNF-α增加和單核細胞mHLA-DR表達增加來逆轉膿毒癥中的免疫抑制?？紤]到IFN-γ本身就是一種促炎因子，有可能導致嚴重的炎癥風暴，需要特別注意其潛在的風險。目前一項納入278例患者的IIb在研臨床研究（NCT03332225，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03332225）將進一步證實其在治療膿毒癥中的療效，免疫抑制評判的標準就是患者mHLA-DR表達連續(xù)兩天小于30%。

3.1.2 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colo?ny stimulating factor，GM-CSF）是一種具有免疫刺激作用的生長因子，可以通過誘導中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的增殖和分化而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。近年來，多項GM-CSF治療膿毒癥的臨床試驗相繼開展［35-37］。Presneill等［35］針對膿毒癥伴有呼吸功能障礙患者開展了一項小樣本的臨床研究。結果發(fā)現(xiàn)靜脈使用小劑量GM-SCF治療后，治療組患者的氧合指數(shù)較安慰劑組改善更加明顯，30 d生存率和器官功能衰竭數(shù)目的差異并無統(tǒng)計學意義。Orozco等［36］也將GM-CSF用于治療非外傷腹腔感染的膿毒癥患者，結果顯示治療組的抗生素使用時間和平均住院時間較對照組明顯縮短，感染相關的并發(fā)癥也有所減少，但兩組在院內死亡率上未發(fā)現(xiàn)明顯差異。2009年，Meisel等［20］將膿毒癥合并免疫抑制狀態(tài)的患者（連續(xù)兩天mHLA-DR＜8000mAb/Cell）隨機分為GM-CSF治療組和生理鹽水對照組。結果發(fā)現(xiàn)GM-CSF治療組在治療24h后所有的患m HLA-DR水平均明顯上升，而對照組僅有15.8%的患者上升；同時，治療組APACHE-Ⅱ評分下降更快，呼吸機使用時間、住院時間和ICU入住時間也明顯縮短。2011年，Bo等［37］將12項GCSF和GM-CSF治療膿毒癥患者的研究進行了Meta分析，共納入2 380例膿毒癥患者，結果發(fā)現(xiàn)G-CSF和GM-CSF并不能改善膿毒癥患者的28 d生存率，這可能與入組患者膿毒癥發(fā)病時間不一、免疫狀態(tài)不同相關。亞組分析發(fā)現(xiàn)，GM-CSF可以增加感染灶的清除?？梢?，過去臨床研究并未發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以改善膿毒癥患者的預后，但其在增強病灶清除率和降低繼發(fā)感染發(fā)生率上顯現(xiàn)出一定的作用。

目前，一項大樣本量的多中心，隨機，雙盲，安慰劑對照的在研臨床試驗（NCT02361528，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02361528）已經開始。這一研究將選擇免疫抑制的膿毒癥患者作為受試者，并且以28 d內ICU獲得性感染發(fā)生率作為這項研究的主要終點事件。該試驗旨在證實GMCSF對于感染病灶的清除和減少繼發(fā)感染的療效，其結果將會成為GM-CSF是否可以使膿毒癥患者獲益提供更加豐富的臨床證據(jù)。

3.2 獲得性免疫增強的治療

3.2.1 白細胞介素-7膿毒癥免疫抑制的機制之一就是淋巴細胞，特別是T淋巴細胞的凋亡和的耗竭。白細胞介素-7（IL-7）作為一種抗細胞凋亡的常見γ鏈細胞因子，對淋巴細胞的增殖和存活至關重要。它可以誘導活化和非活化T細胞的增殖，抑制其凋亡，從而逆轉膿毒癥病程中淋巴細胞的減少。

近期，全球第一項驗證IL-7治療膿毒癥患者療效的前瞻性，隨機，雙盲，安慰劑對照的Ⅱ期臨床試驗已經完成［38］。該研究納入了27名膿毒性休克和嚴重淋巴細胞減少的患者。受試者隨機接受重組人IL-7（CYT107）或安慰劑治療4周，研究的主要目的是確定CYT107在膿毒癥治療中逆轉淋巴細胞減少的能力及其安全性。結果發(fā)現(xiàn)CYT107治療后絕對淋巴細胞計數(shù)和循環(huán)中CD4+和CD8+T細胞數(shù)目較基礎狀態(tài)增加3～4倍，是否能改善膿毒癥患者的預后還需要更大樣本量的Ⅲ期臨床研究來進一步驗證。

3.2.2 胸腺肽α1胸腺肽α1（Tα1）是一種天然分泌的小分子物質，主要由胸腺分泌。1972年，Goldstein等［39］首次從胸腺Ⅴ肽提取出Tα1。Tα1作為調節(jié)因子在天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)中均可發(fā)揮作用。

目前，Tα1被用于治療與免疫紊亂有關的疾病，包括乙肝病毒感染、某些癌癥、以及作為疫苗強化劑。近年來中國已經進行了多項關于Tα1治療膿毒癥的臨床研究［40］。2013年，我們完成了一項納入361例膿毒癥患者的多中心隨機對照研究（ETASS研究）［41］，旨在探討Tα1在治療膿毒癥中的療效和安全性。所有患者被隨機分配至對照組（n=180）或Tα1組（n=181）。治療組接受7天療程的治療。結果發(fā)現(xiàn)Tα1與對照組相比，Tα1治療組患者的mHLA-DR改善的更加明顯，預后更好。2018年本課題組發(fā)起了一項胸腺肽α1治療膿毒癥的多中心隨機雙盲對照研究（NCT02867267，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02867267）目前正在募集受試者，預計納入1106名膿毒癥患者，希望通過這項大樣本臨床研究能夠為Tα1治療膿毒癥的提供更加充分的臨床證據(jù)。

3.2.3 免疫球蛋 白靜脈免疫球蛋白（IVIG）可中和細菌內毒素和外毒素。SBITS研究［42］（n=624）和ESSICS研究［43］（n=218）是目前研究IVIG治療膿毒癥樣本量最多的兩項隨機對照研究。這兩項RCT研究的結果均證明IVIG并不能改善膿毒癥患者的生存預后。Cochrane分別對免疫球蛋白IgG（IVIG）和免疫球蛋白IgM（IVIGM）治療膿毒癥分別進行了meta分析。在10項IVIG治療的研究中共納入了1 430例患者。結果發(fā)現(xiàn)IVIG組患者在28～180天的死亡率為29.6%，安慰劑組為36.5%（RR：0.81；95%CI：0.70-0.93）。在7項IVIGM的研究中（n=528例），IVIGM組28～60 d的死亡率為24.7%，安慰劑組為37.5%（RR：0.66；95%CI：0.51-0.85）。分析這些研究的偏倚和異質性風險發(fā)現(xiàn)，關于IVIG和IVIGM的meta分析的結果均存在中到高等的偏倚風險?，F(xiàn)有的對于IVIG和IVIGM的研究大多數(shù)都樣本量偏小、偏倚風險較高，幾個大型的RCT研究都未能證明免疫球蛋白可以改善膿毒癥患者的死亡率。因此，SSC指南不推薦對于膿毒癥患者使用免疫球蛋白，需要更多高質量的臨床研究來進一步證明它在膿毒癥治療中的療效。

3.2.4 抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體 抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體作為抑制性免疫檢查點的抗體能夠恢復T細胞的功能，認為也可以用于治療膿毒癥免疫抑制患者。2019年兩項I期臨床試驗［44-45］首次證實了抗PD-L1和PD-1抗體在膿毒癥治療中的安全性，患者耐受性良好，沒有引起炎癥風暴的發(fā)生。兩類藥物都有助于膿毒癥免疫抑制患者mHLA-DR的恢復。評估其在膿毒癥患者中的臨床安全性和有效性還需要進一步證實。

3.3 中醫(yī)藥治療

中醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，有多種藥物已被初步證明具有提高機體天然免疫和獲得性免疫的多靶點功效，這與膿毒癥復雜的免疫抑制發(fā)病機制相契合。因此，中醫(yī)藥在膿毒癥免疫調節(jié)中的作用正在被挖掘，結合臨床研究，中醫(yī)藥提高膿毒癥免疫功能的作用也逐漸被國際同行所重視［46-47］，但還需要更多嚴謹透徹的機制實驗和高水平的臨床研究進一步證實中醫(yī)藥在膿毒癥免疫調節(jié)中的獨特作用。

4 小結與展望

目前治療膿毒癥的標準方案是早期復蘇、感染灶清除、抗菌藥物使用和器官支持，但是在嚴格依照標準方案治療后，膿毒癥病死率仍然居高不下。隨著我們對于膿毒癥誘導的免疫抑制在器官功能損害和死亡中重要性的認識日益加深，圍繞著膿毒癥患者天然免疫和獲得性免疫的監(jiān)測和治療的研究逐漸深入，出現(xiàn)了一種新的治療模式——膿毒癥免疫治療。在這個全新的領域我們需要明確：膿毒癥是一種多種病因引起的異質性較大的臨床綜合征，并不是簡單的單一疾病！通過免疫治療確定最有可能從中受益的患者，準確地監(jiān)測免疫功能和治療反應，從中篩選出合適的指標和治療方案。