吳玉冰，尹莉芳，秦 超

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南京211198）

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是組織的細(xì)胞外組分，能夠起到為細(xì)胞提供支持、儲存生長因子、調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞間通訊的作用。ECM由多種基質(zhì)大分子組成，這些基質(zhì)大分子的具體組成和結(jié)構(gòu)因組織而異。ECM的主要成分包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖等［1］。在涉及維持組織穩(wěn)態(tài)和再生的生物過程（例如傷口愈合和纖維化）中，ECM的形成和降解是其中的關(guān)鍵［2］，控制這一關(guān)鍵生理過程的酶被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMPs是鋅依賴型內(nèi)切酶，能夠共同切割ECM的所有成分。

目前，在脊椎動物中共鑒定出24種已知的MMPs，其中23種被發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)有表達(dá)。MMPs使用數(shù)字進(jìn)行編號，從MMP-1到MMP-28。但是由于有不同團(tuán)隊(duì)同時(shí)發(fā)現(xiàn)同一種MMP的情況出現(xiàn)，所以MMPs的編號中不包括MMP-4、MMP-5、MMP-6 和 MMP-22［3］?；谠隗w外的底物特異性，可以將MMPs分為7類［1，4］：（1）膠原酶（collagenases），包括 MMP-1、MMP-8、MMP-13和 MMP-18，能夠切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型間質(zhì)膠原蛋白；（2）明膠酶（gelatinases），包括MMP-2和MMP-9，能夠切割變性的膠原蛋白（明膠）和基底膜蛋白；（3）基質(zhì)溶解素（stromelysins），包括 MMP-3、MMP-10和 MMP-11，能夠切割層粘連蛋白和其他基底膜蛋白；（4）間質(zhì)溶素（matrilysins），包括MMP-7和MMP-26，缺乏羧基末端結(jié)構(gòu)域，能夠切割蛋白多糖、層粘連蛋白、彈性蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等；（5）膜型MMPs（MTMMPs），在細(xì)胞表面表達(dá)并通過糖磷脂酰肌醇錨（MMP-17和 MMP-25）或跨膜結(jié)構(gòu)域（MMP-14、MMP-15、MMP-16和MMP-24）與質(zhì)膜連接；（6）金屬彈性蛋白酶（metalloelastase），包括MMP-12，切割彈性蛋白和一些基底膜蛋白；（7）其他MMPs，包括MMP-19、MMP-20、MMP-23和MMP-28。

大多數(shù)MMPs不是組成型表達(dá)的，并且大多數(shù)細(xì)胞需要被激活以表達(dá)MMPs。MMPs的活性在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平以及細(xì)胞定位中受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)［4］。MMPs與其抑制劑之間的平衡相互作用受到影響后會引起各種疾病，例如炎癥、關(guān)節(jié)炎、牙周病、血管疾病、糖尿病、纖維化、腫瘤、惡性血液病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。由于它們在許多疾病中的重要作用，MMPs已經(jīng)成為許多疾病治療的靶點(diǎn)以及疾病診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物。

本文主要總結(jié)MMPs作為生物標(biāo)志物在各種疾病診斷中的應(yīng)用以及檢測方法，以期對MMPs的臨床應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

1 基質(zhì)金屬蛋白酶在疾病診斷中的應(yīng)用

MMPs參與到人體許多生理功能中，例如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫功能、組織愈合以及血管生成等。并且MMPs的活性在轉(zhuǎn)錄、翻譯、酶促激活和調(diào)節(jié)蛋白的抑制等方面都受到嚴(yán)密的調(diào)控。MMPs也參與到許多病理過程中［5］，例如組織破壞（如腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、潰瘍、炎癥性疾病等），纖維化（如肝硬化、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化等），基質(zhì)降解（如心肌病、主動脈瘤）以及各種骨關(guān)節(jié)疾病等。因此MMPs及其抑制劑TIMP被認(rèn)為是許多疾病的潛在生物標(biāo)志物，可以應(yīng)用于疾病診斷，預(yù)后和監(jiān)測中。

1.1 腫瘤

ECM是腫瘤微環(huán)境基質(zhì)的非細(xì)胞成分，在腫瘤中形成支架，主要負(fù)責(zé)促進(jìn)腫瘤惡性表型［6］。腫瘤組織中的ECM主要由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）產(chǎn)生，作為一種大分子復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，具有獨(dú)特的物理、生化、生物力學(xué)性質(zhì)，并隨著腫瘤的發(fā)展經(jīng)歷廣泛的重塑［7］。人體內(nèi)的MMPs家族由23種內(nèi)肽酶組成，這些酶在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移［8］和血管生成［9］中具有重要作用。它們還對細(xì)胞行為產(chǎn)生顯著影響，如轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的生長和上皮細(xì)胞運(yùn)動性的增加。MMPs在ECM重塑中起到了關(guān)鍵作用，并且參與各種形式的腫瘤進(jìn)展，因此，MMPs作為腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性侵襲的生物標(biāo)志物，已經(jīng)逐漸成為臨床監(jiān)測多種腫瘤的重要工具。

2017年，Peisker等［10］研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者與對照組相比，唾液中的MMP-9水平明顯升高，通過檢測唾液中MMP-9的變化有助于臨床口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期檢測。Eissa等［11］的研究結(jié)果也表明，尿液中MMP-9/TIMP-2和MMP-2/TIMP-2的比值可以作為膀胱癌的新型標(biāo)志物。相比于單個蛋白的生物指標(biāo)，MMP-9/TIMP-2和MMP-2/TIMP-2的比值的敏感性和特異性都有顯著增加，并且提高了在淺表和低度惡性腫瘤中的敏感性。

另外，MMPs在實(shí)體瘤中呈現(xiàn)特異性的時(shí)空分布，針對過表達(dá)MMPs設(shè)計(jì)熒光探針可以對腫瘤進(jìn)行生物成像，有助于腫瘤的精確診斷和治療。Cheng等［12］設(shè)計(jì)了以熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）為原理，同時(shí)對MMP-2和Caspase-3進(jìn)行生物成像的熒光探針。這種熒光探針可以對MMP-2和Caspase-3分別獨(dú)立進(jìn)行時(shí)間和空間定位，有望應(yīng)用于簡化精確腫瘤診斷和成像過程。

1.2 心血管疾病

正常心肌擁有許多種ECM蛋白，包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和低水平的基質(zhì)細(xì)胞蛋白。這些蛋白都在心臟的生理功能中發(fā)揮作用，其中最豐富的是膠原蛋白，它能夠形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，為心肌提供三維結(jié)構(gòu)和拉伸強(qiáng)度［13］。在心血管疾病中，膠原網(wǎng)絡(luò)的破壞需要可以切割膠原蛋白的MMPs參與。MMPs在血管重塑和血管生成［14-15］，側(cè)支動脈形成［16］和血栓形成與消退［17］等多個過程中起重要作用，并且與動脈粥樣硬化、主動脈瘤、缺血性卒中等多種血管疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［18］。因此，多種 MMPs，包括 MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8和MMP-9等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)可以用作心血管疾病的診斷和監(jiān)測工具。

Kormi等［19］對 7 928 名受試者進(jìn)行調(diào)查和隨訪，發(fā)現(xiàn)MMP-8的血清濃度與冠狀動脈疾病、心肌梗死、腦卒中等多種心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。MMP-8與TIMP-1的比值與心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)存在顯著相關(guān)性。將MMP-8和TIMP-1作為生物標(biāo)志物有助于預(yù)測心血管疾病和死亡風(fēng)險(xiǎn)。2017年，Zhong等［20］對來自中國急性缺血性卒中抗高血壓試驗(yàn)（CATIS）的3 186名參與者的血清MMP-9進(jìn)行了測量，發(fā)現(xiàn)血清MMP-9水平升高與死亡和嚴(yán)重殘疾風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，血清MMP-9可能是缺血性卒中的重要預(yù)后因素。因此將血清MMP-9加入常規(guī)危險(xiǎn)因素進(jìn)行監(jiān)測可能改善對死亡或嚴(yán)重殘疾結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。

1.3 炎癥性疾病

MMPs可以在各種水平上協(xié)調(diào)炎癥功能。它們可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞從脈管系統(tǒng)向組織中炎癥部位的遷移，還通過加工ECM成分、生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的募集和向炎癥部位的流入［21］，在生理和病理學(xué)上都積極參與到炎癥反應(yīng)中，是炎癥標(biāo)志物之一。MMPs作為炎癥標(biāo)志物可以幫助診斷和治療某些炎癥性疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［22-23］，牙科炎癥［24］和羊膜內(nèi)炎癥導(dǎo)致的早產(chǎn)［25-26］等。

Zhou等［27］對151名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行血清MMP-3水平的測試和關(guān)節(jié)超聲評分，發(fā)現(xiàn)血清MMP-3水平與關(guān)節(jié)超聲評分結(jié)果密切相關(guān)，可以有效反映中重度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的疾病活動，并且可以靈敏且穩(wěn)定地監(jiān)測中重度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的治療反應(yīng)。血清MMP-3和關(guān)節(jié)超聲評分的聯(lián)合使用可以作為臨床監(jiān)測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動和治療功效的簡單且準(zhǔn)確的評估方法。Aleksandrowicz等［28］曾報(bào)道種植體周圍齦溝液中的MMP-8水平與黏膜炎或種植體周圍炎相關(guān)。通過監(jiān)測種植體周圍齦溝液中的MMP-8水平，有助于在表現(xiàn)出臨床癥狀之前對黏膜炎或種植體周圍炎進(jìn)行早期診斷并迅速進(jìn)行治療。

1.4 神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和亨廷頓舞蹈病等，是一種以神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能逐漸喪失為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的ECM主要由蛋白多糖組成，對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、存活和活動至關(guān)重要。MMPs主要通過以下方式參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)病變常見的神經(jīng)炎癥過程［29］：（1）ECM蛋白水解；（2）細(xì)胞增殖、分化和遷移；（3）炎癥介質(zhì)的激活和失活；（4）血-腦脊液屏障的通透性。因此，MMPs的水平變化可能作為神經(jīng)退行性疾病早期診斷和疾病監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。

Valado等［30］對葡萄牙人群中多發(fā)性硬化癥患者M(jìn)MP-9血清濃度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化癥患者的血清MMP-9顯著高于健康人，并且MMP-9有作為IFN-β治療患者預(yù)后效果的標(biāo)志物的潛力。2016年，Gerwien等［31］曾報(bào)道使用一種熒光和放射性標(biāo)記的MMP抑制劑觀察自身免疫性腦脊髓炎（一種多發(fā)性硬化癥）動物模型腦中的MMP活性，并使用放射性MMP配體進(jìn)行MMP活性的正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像。通過追蹤MMP活性，檢測到多發(fā)性硬化癥早期的病變和持續(xù)白細(xì)胞浸潤，作為一種非侵入手段，監(jiān)測多發(fā)性硬化癥病變的形成和進(jìn)展。

1.5 其他疾病

由于MMPs對人體許多病理過程的廣泛參與，還有其他許多疾病也可以利用MMPs作為診斷或預(yù)后的檢測指標(biāo)。Zhou等［32］研究發(fā)現(xiàn)，不同腎病患者的尿液中MMP-7水平顯著高于正常受試者，并且尿液中MMP-7水平與腎纖維化評分密切相關(guān)。MMP-7可以作為腎臟纖維化病變的非侵入性生物標(biāo)志物，并且還是纖維化的重要致病介質(zhì)。Sigal等［33］對70種潛在生物標(biāo)志物與結(jié)核病的相關(guān)性進(jìn)行了篩選，MMP-8是最終被確認(rèn)與疾病嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)相關(guān)的7種生物標(biāo)志物之一。通過測量血液中MMP-8，可以確定疾病嚴(yán)重性并在治療期間對疾病進(jìn)行監(jiān)測。Lertudomphonwanit等［34］曾報(bào)道MMP-7可以作為膽道閉鎖的診斷生物標(biāo)志物，并且當(dāng)MMP-7與膽汁淤積的標(biāo)志物γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）組合時(shí)，診斷性能能夠達(dá)到95%。

2 基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測

在MMPs的表達(dá)過程中，MMPs先通過轉(zhuǎn)錄、翻譯的過程以酶原的形式產(chǎn)生，隨后通過蛋白水解或化學(xué)激活，才能夠最終生成具有活性的MMPs。根據(jù)在這一過程中檢測目標(biāo)物的不同，可以將MMPs的檢測方法分為3類：（1）基于RNA水平的檢測；（2）基于蛋白水平的檢測；（3）基于MMPs的水解酶活性的檢測。

2.1 RNA水平

MMPs的合成需要經(jīng)過mRNA的轉(zhuǎn)錄。通過檢測mRNA的水平，就能夠研究MMPs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。常用的檢測mRNA的方法主要包括反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸探針和Northern印跡雜交。

2.1.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） RTPCR是先將RNA反轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA（cDNA）后，再以cDNA作為模板通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的一種PCR技術(shù)。通過使用熒光監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)可以將實(shí)時(shí)熒光定量PCR與RT-PCR結(jié)合，對特定RNA序列進(jìn)行快速靈敏的定量檢測，該技術(shù)被廣泛用于研究和臨床環(huán)境中的基因表達(dá)分析和病毒RNA定量。Lee等［35］為了研究缺氧和促炎刺激對類風(fēng)濕炎癥關(guān)節(jié)中的MMP-1和MMP-13表達(dá)情況，在缺氧和常氧條件下，使用實(shí)時(shí)半定量RT-PCR檢測了IL-1β刺激下滑膜成纖維細(xì)胞的VEGF、MMP-1和MMP-13的分泌水平。

2.1.2 核酸探針 核酸探針是指將已知堿基序列的核酸在體內(nèi)或體外進(jìn)行標(biāo)記，使其可以通過堿基互補(bǔ)配對特異性檢測組織或細(xì)胞中目標(biāo)DNA或RNA，直接、簡便地研究目的基因表達(dá)和定位的一種技術(shù)。根據(jù)核酸探針的來源和性質(zhì)可以將其分為cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。Shiozawa等［36］曾使用與人MMP-1 mRNA片段互補(bǔ)的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交來檢測MMP-1 mRNA，從而研究MMP-1在人大腸癌中起到的作用。探針在3′尾端用洋地黃毒苷進(jìn)行標(biāo)記。

2.1.3 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交是通過電泳分離不同相對分子質(zhì)量的RNA后將其轉(zhuǎn)印到印跡膜上，并使用與部分或全部靶序列互補(bǔ)的雜交探針進(jìn)行檢測的技術(shù)。Northern印跡檢測的優(yōu)勢包括可以檢測RNA大小，觀察剪接產(chǎn)物等，并且轉(zhuǎn)印完成的印跡膜可以進(jìn)行長期儲存和重復(fù)檢測。與RT-PCR相比，Northern印跡法靈敏度較低，但特異性高，可以減少檢測中的假陽性結(jié)果。Li等［37］為了確定結(jié)膜松弛癥是否與MMPs的表達(dá)與活性高于TIMPs相關(guān)，使用Northern雜交對正常人和患者結(jié)膜成纖維細(xì)胞中的MMPs、TIMPs和尿激酶纖溶酶原激活劑（uPA）的mRNA水平進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)患者結(jié)膜成纖維細(xì)胞中MMP-1和MMP-3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著增加。

2.2 蛋白質(zhì)水平

基于蛋白質(zhì)水平的檢測即利用免疫手段對MMPs進(jìn)行檢測，是通過抗原抗體的特異性結(jié)合對MMPs進(jìn)行識別。這些方法需要使用到價(jià)格較為昂貴的抗MMPs抗體，可以識別酶原形式的MMPs和活性MMPs。

2.2.1 Western印跡雜交 Western印跡雜交是分子生物學(xué)及生物化學(xué)等多種學(xué)科中廣泛使用的分析技術(shù)，用于定性和半定量檢測單個蛋白質(zhì)和蛋白修飾，特異性強(qiáng)、靈敏度高，但操作繁瑣，成本較高。2019年，Ando等［38］的研究中，將Western印跡雜交作為乳腺癌患者尿液外泌體中MMP-1蛋白水平的檢測手段，發(fā)現(xiàn)MMP-1有可能成為乳腺癌篩查的生物標(biāo)志物。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） ELISA是一種固相酶免疫測定（EIA），在各行業(yè)中都被廣泛使用。通常形式的ELISA測定是將具有未知抗原量的樣品特異性或非特異性地固定在固體支持物表面，然后添加檢測抗體與抗原形成復(fù)合物。檢測抗體可以使用與酶連接的二抗進(jìn)行檢測或直接使用酶標(biāo)記的抗體作為檢測抗體。最后添加酶促底物產(chǎn)生可見信號，通常使用呈色反應(yīng)進(jìn)行檢測。Farkas等［39］曾通過使用ELISA測定炎性腸病患者糞便中的MMP-9水平，發(fā)現(xiàn)糞便MMP-9對檢測內(nèi)鏡下活躍的潰瘍性結(jié)腸炎和囊袋炎具有很高的靈敏度，可以作為評估腸道炎癥的非侵入性方法。

2.2.3 免疫組織化學(xué)（IHC） 免疫組化是利用特異性抗體選擇識別組織切片細(xì)胞中抗原的一種免疫染色技術(shù)。抗體通常與酶或熒光基團(tuán)連接進(jìn)行可視化檢測。免疫組化技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于診斷異常細(xì)胞以及對特定分子標(biāo)志物的檢測。通過使用這一檢測方法，可以了解生物標(biāo)志物和差異表達(dá)蛋白在生物組織不同部位的分布和定位。Roy等［40］為了研究胰腺惡性腫瘤能否使用尿液MMPs或TIMPs作為疾病預(yù)測因子，使用免疫組化技術(shù)分析了腫瘤和正常胰腺組織中的生物標(biāo)志物表達(dá)，并與尿液檢測結(jié)果進(jìn)行對照，發(fā)現(xiàn)MMP-2和TIMP-1可能在胰腺惡性腫瘤的檢測中具有診斷價(jià)值。

2.2.4 免疫熒光 免疫熒光是通過抗原抗體特異性結(jié)合來對細(xì)胞內(nèi)特定生物分子靶標(biāo)進(jìn)行定位的免疫染色技術(shù)。免疫熒光可以觀察到目標(biāo)分子或結(jié)構(gòu)在樣品中的分布，并進(jìn)行半定量分析。通過與具有不同功能的顯微鏡結(jié)合，可以達(dá)到超高分辨率成像、實(shí)時(shí)跟蹤、分層掃描等效果。Zhou等［41］在研究MMP-1在大鼠脊髓損傷模型中的表達(dá)時(shí)，使用了免疫熒光染色對MMP-1進(jìn)行了免疫反應(yīng)性和共定位研究。

2.2.5 電化學(xué)磁免疫傳感器 磁分離酶聯(lián)免疫測定（magnetic affinity immunoassay，MAIA）是一種使用磁珠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的固相載體對樣品中抗原進(jìn)行分離的免疫測定方法。通過使用抗體標(biāo)記的磁珠與目標(biāo)抗原結(jié)合，利用磁力分離代測樣品中的目標(biāo)抗原。MAIA的方法和原理與ELISA和Western blot非常相似，但可以在液體介質(zhì)中進(jìn)行檢測，具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、樣品用量少等特點(diǎn)。將MAIA與電化學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合可以用來開發(fā)電化學(xué)磁免疫傳感器（electrochemical magneto-immunosensors），大幅度提高檢測靈敏度和通量，簡化檢測步驟。2018年，Ruiz-Vega等［42］使用辣根過氧化物酶聚合共軛物（Poly-HRP）作為信號放大器，開發(fā)了單步僅需5 min的MMP-9磁免疫測定法，并生產(chǎn)了一種簡單便宜的磁性固定器用于多重電化學(xué)檢測。該檢測法可以使用現(xiàn)成的商用底物溶液，并且足夠簡便快速，可以應(yīng)用于現(xiàn)場護(hù)理或由非專業(yè)人員進(jìn)行檢測。

2.3 MMPs的水解酶活性

MMPs是一種鋅依賴型的內(nèi)切酶。根據(jù)酶對底物的特異性，可以使用MMPs的底物（通常是明膠）或特定的氨基酸序列對MMPs進(jìn)行識別，并使用不同方式產(chǎn)生可檢測的信號。這些方法可以只檢測具有活性的MMPs的水平，直接反應(yīng)樣品中MMPs的活性變化。

2.3.1 明膠酶譜 明膠酶譜法是以明膠作為底物，對明膠敏感的MMPs（MMP-2和MMP-9）進(jìn)行測定的一種酶譜檢測。根據(jù)檢測部位不同可以分為凝膠酶譜、原位酶譜和體內(nèi)酶譜。由于MMP-2和MMP-9對明膠的特異性，明膠酶譜法作為一種高靈敏度、低成本的檢測方法被廣泛應(yīng)用于MMP-2和MMP-9的檢測中。Fietz等［43］使用明膠酶譜法對馬關(guān)節(jié)中的MMP-2和MMP-9進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)疾病關(guān)節(jié)中MMP-2和MMP-9的活性均有所升高。

2.3.2 敏感肽 使用可以被MMPs特異性切割的敏感肽與不同檢測基團(tuán)結(jié)合可以制備MMPs特異性探針。由于MMPs敏感肽連接方便、特異性高，可以作為一種通用的MMPs識別方式與多種不同的信號檢測方式進(jìn)行組合，得到廣泛應(yīng)用。

（1）熒光成像 MMPs敏感肽最常見的應(yīng)用方式是與各種熒光基團(tuán)連接，利用熒光成像進(jìn)行檢測和定位。例如在熒光探針中，可以通過熒光共振 能 量 轉(zhuǎn) 移（F?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）使熒光基團(tuán)淬滅。當(dāng)敏感肽被MMPs特異性切割時(shí)，熒光基團(tuán)釋放恢復(fù)熒光，產(chǎn)生可檢測的熒光信號。

Li等［44］使用從量子點(diǎn)（供體）到有機(jī)染料（受體）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合MMP-2特異性肽底物制備MMP-2特異性熒光探針。當(dāng)探針暴露于MMP-2時(shí)，多肽的選擇性切割導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光恢復(fù)。該探針可以應(yīng)用于腫瘤部位MMP-2的監(jiān)測中。2016年，Han等［45］報(bào)道了一種基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流體裝置，其中固定了水凝膠構(gòu)架的納米纖維基質(zhì)。FITC熒光標(biāo)記的MMP-9特異性肽被固定到納米纖維基質(zhì)上。當(dāng)敏感肽在反應(yīng)室中與含MMP-9的溶液反應(yīng)時(shí)，F(xiàn)ITC被釋放，在檢測區(qū)產(chǎn)生熒光流。該檢測方式相應(yīng)快速，檢測限低，并且微流體系統(tǒng)可以重復(fù)使用。

（2）化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移 化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移（chemical exchange saturation transfer，CEST）是一種核磁共振成像新方法。它是通過使用特定脈沖對特定物質(zhì)（比如蛋白質(zhì)、葡萄糖、黏多糖等生物大分子）中的氫質(zhì)子進(jìn)行飽和，飽和氫質(zhì)子通過化學(xué)交換，影響水分子信號的變化，通過檢測水的信號，可以間接反應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的含量。使用鑭系金屬螯合物可以制成順磁性CEST對比劑，以加強(qiáng)CEST效應(yīng)。2017年，F(xiàn)errauto等［46］報(bào)道了一種脂質(zhì)體CEST檢測劑，使用MMP-2敏感肽在脂質(zhì)體表面連接生物素和親和素分子。通過MMP-2切割后脂質(zhì)體內(nèi)水共振的化學(xué)位移來定量檢測MMP-2的水平。

（3）電化學(xué)生物傳感器 使用電化學(xué)傳感器檢測MMPs除了使用特異性抗體修飾的免疫傳感器，還可以使用可被酶降解的天然或合成底物包被在電極表面，制成活性傳感器。通過電極將目標(biāo)分子的濃度信息轉(zhuǎn)換成電勢、電流、電阻或電容等可測量的響應(yīng)信號，從而進(jìn)行定性或定量檢測，該方法具有靈敏度高、易微型化等特點(diǎn)。Biela等［47］使用氧化葡聚糖包被電極，并與含有MMP-9特定切割位點(diǎn)的肽交聯(lián)來生產(chǎn)生物傳感器。薄膜暴露于酶后導(dǎo)致薄膜降解，可以通過測量阻抗來進(jìn)行檢測。傳感器響應(yīng)迅速，在添加MMP-9后5 min內(nèi)即可觀察到明顯的阻抗變化。

2.3.3 基于活性位點(diǎn)的熒光探針 由于MMPs是鋅依賴型的內(nèi)切酶，通過檢測MMPs催化活性區(qū)的鋅離子，可以檢測活性MMPs。Li等［48］報(bào)道了一種針對MMP活性位點(diǎn)中的Zn2+的DNA探針，MMPs的金屬位點(diǎn)可以在紫外光下暴露，通過次氮基三乙酸（NTA）修飾的核酸探針可以與其結(jié)合，再通過FITC和BHQ1修飾的分子信標(biāo)進(jìn)行熒光成像，實(shí)現(xiàn)對活性MMP-9的特異性檢測。

3 結(jié)語

隨著對MMPs作為生物標(biāo)志物的進(jìn)一步研究，其檢測技術(shù)也得到了快速發(fā)展。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法繁瑣耗時(shí)，已經(jīng)不能滿足臨床疾病診斷和跟蹤評估的要求，人們對更加快速、靈敏、簡單、高通量檢測方法的需求日益增加。近年來，隨著電化學(xué)檢測技術(shù)、測流色譜技術(shù)［49］、生物芯片技術(shù)［50］等新型檢測技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)有人嘗試將這些檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的MMP-2檢測方法相結(jié)合，以開發(fā)可以滿足臨床檢測需求的檢測系統(tǒng)?？梢云诖禺愋愿?、反應(yīng)靈敏的快速檢測方法成功完成開發(fā)并且進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從而為相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療提供一種經(jīng)濟(jì)快速的輔助檢測方案，并為相關(guān)藥物的研發(fā)提供支持。