儲(chǔ)娜，孫會(huì)東，周敬如，傅華英，李曉燕，高三基

（福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

0 引言

甘蔗（Saccharumspp.）是中國乃至全球重要的糖料作物，甘蔗糖分別占我國和全球食糖總量的90%[1]和80%[2]。甘蔗除了制糖，還可以生產(chǎn)燃料乙醇、制作青貯飼料，制糖副產(chǎn)品還可以進(jìn)行高值化、資源化為目的的多元化利用。甘蔗病害種類至少有130 多種，我國有記載的病害至少50 余種[3]。甘蔗細(xì)菌性病害主要有由燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N[Acidovorax avenuesubsp.avenae（Aaa）]引起的赤條病，由木質(zhì)部賴氏菌木質(zhì)部亞種（Leifsonia xylisubsp.xyli）引起的宿根矮化病，由白條黃單胞桿菌（Xanthomonas albilineans）引起的白條病和由地毯草流膠病黃單胞桿菌（X.vasicolapv.vasculorum）引起的流膠病[4-5]。其中，甘蔗赤條病是一種全球普遍發(fā)生的病害，其葉條斑型對(duì)甘蔗生產(chǎn)不會(huì)造成嚴(yán)重影響，但是該病害頂腐型會(huì)引起植株死亡，對(duì)甘蔗及其蔗糖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本文擬從甘蔗赤條病基本情況及其致病菌的生物學(xué)基本特性和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究等方面內(nèi)容進(jìn)行綜述，并對(duì)該病害的生態(tài)防控和今后的研究重點(diǎn)進(jìn)行探討，以期為甘蔗赤條病的有效防控提供參考。

1 甘蔗赤條病基本情況

1.1 病害發(fā)生與危害

早在1895 年阿根廷報(bào)道的一種眾所周知的“Polvillo”病害，可能是甘蔗赤條病。上世紀(jì)20 年代美國夏威夷將這種病害癥狀描述為紅色條斑，命名為細(xì)菌性紅色條斑病，其病菌最早于1925年由Lee和Martin分離獲得，并通過接種鑒定證實(shí)[6]。該病害在澳大利亞、美國、古巴、阿根廷、巴基斯坦等50 多個(gè)國家或地區(qū)均有發(fā)生[7]。近年來，該病害在阿根廷蔗區(qū)暴發(fā)，造成甘蔗經(jīng)濟(jì)損失30%[4]。上世紀(jì)80 年代在我國廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣等省份也有甘蔗赤條病發(fā)生，有的蔗區(qū)田間自然發(fā)病率高達(dá)到60%[8]。最近，云南省元江縣蔗區(qū)也出現(xiàn)了甘蔗赤條病[9]。我國蔗區(qū)赤條病幾乎每年都有發(fā)生，引起甘蔗減產(chǎn)、品質(zhì)下降[10]。

1.2 病害典型癥狀

甘蔗赤條病的癥狀有兩種類型：葉條斑和頂腐，兩者可以單獨(dú)發(fā)生，也可同時(shí)發(fā)生[6-8]。葉條斑型：癥狀一般多發(fā)生于嫩葉葉片中部，靠近中脈部位，最初表現(xiàn)為水漬狀褪綠條紋，隨后向兩端迅速擴(kuò)展成長(zhǎng)條狀紅色至紅褐色病斑。葉片條斑的發(fā)病組織與健康組織有明顯的界限，寬度為0.5～4 mm，長(zhǎng)幾十毫米至葉片全長(zhǎng)。有時(shí)2條或多條條斑連接成帶狀，某些品種可延伸至葉鞘。在葉片下表皮病斑上，常常可見到一層薄薄粉末狀的細(xì)菌溢出物。在寒冷干燥的條件下，條斑的邊緣具有黃暈，以后條斑彼此組合成赤條與黃暈相間的寬帶。頂腐型：植株表現(xiàn)為老葉黃化、枯萎，其早期癥狀是甘蔗生長(zhǎng)點(diǎn)附近的維管束變紅、腐爛，進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致節(jié)間大腔穴的形成，后期心葉腐爛，可以從外面包著的葉鞘中拉出來，并具有一種特殊的難聞臭味。嚴(yán)重發(fā)病的頂腐型植株蔗莖內(nèi)部組織從上往下腐爛，直至基部，甘蔗生長(zhǎng)受到抑制，一般枯死。有時(shí)植株蔗莖最上部的一些芽會(huì)長(zhǎng)出側(cè)枝，這些側(cè)枝上的葉片可能表現(xiàn)出葉條斑型的癥狀。嚴(yán)重發(fā)病的蔗莖，芽一般發(fā)生腐爛，即使沒有腐爛，蔗種長(zhǎng)出的幼苗也容易死亡[8]。

1.3 寄主范圍

燕麥?zhǔn)乘峋鷮偌?xì)菌能侵染許多重要的單子葉和雙子葉植物[11-12]。燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N屬于食酸菌屬（Acidovorax）的一個(gè)亞種，其自然寄主范圍有甘蔗、高粱、玉米、燕麥、黍和狐尾草等一些禾本科植物[6]，此外，還有水稻[13]、大鶴望蘭（Strelitzia nicolai）[14]、匍匐翦股穎（Agrostis stoloniferaL.）[11]和美人蕉（Cannasp.）[15]。食酸菌屬還有兩個(gè)亞種，即燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N（A.avenuesubsp.citrulli），主要侵染西瓜和葫蘆科植物；燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ靥m亞種（A.avenuesubsp.cattleyae），只侵染卡特蘭和蝴蝶蘭[12]。

1.4 傳播途徑與病害循環(huán)

甘蔗赤條病在田間主要靠風(fēng)、雨傳播，通過蔗種、機(jī)械途徑傳播的可能性很小，昆蟲可傳播病菌，但不是主要的傳播媒介[6,8]。在潮濕溫暖的條件下容易發(fā)病，一般5～7 d 便可產(chǎn)生典型癥狀。甘蔗赤條病病原菌從葉片上、下表皮的氣孔和傷痕處侵入，并在入口處薄壁組織的細(xì)胞間隙大量繁殖，然后侵入維管束中的各組織，特別是導(dǎo)管更容易充滿病菌，并在導(dǎo)管中縱向蔓延。病葉的傷痕表面常有細(xì)菌溢泌物，可借助雨水和氣流，在植株個(gè)體間、田塊間傳播。在病害侵染循環(huán)中，田間帶病菌的殘葉或者中間寄主雜草是病害的初侵染源。病原菌可以在土壤中存活32 d，在患病的枯老蔗葉、蔗莖中經(jīng)4個(gè)月后仍然有致病力[8]。

2 病原菌生物學(xué)基本特性

2.1 病原菌分類地位

甘蔗赤條病最開始被認(rèn)為是由紅條紋假單胞菌（Pseudomonas rubrilineansStapp）引起[6]，隨后，Willems等[16]將它重新命名為食酸菌屬（Acidovorax）燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N。食酸菌屬（Acidovorax）最早由Willems等[17]提出，他根據(jù)細(xì)菌的DNA/rRNA 和DNA/DNA 雜交、生化指標(biāo)、生長(zhǎng)培養(yǎng)特性、脂肪酸圖譜以及全細(xì)胞蛋白質(zhì)聚丙酰胺凝膠電泳等結(jié)果，將假單胞菌屬（Pseudomonass）的敏捷假單胞菌（P.facilis）和德氏假單胞菌（P.delafieldii）以及一些假單胞菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）等株系分出另立為食酸菌屬，包括了敏捷食酸菌（A.facilis）、德氏食酸菌（A.delafieldii）和中等（溫和）食酸菌（A.temperans）。隨后，Willems 等人[16]還將假單胞菌燕麥假單胞菌（P.avenae）和魔芋假單胞菌（P.konjaci）移入食酸菌屬，分別稱為燕麥?zhǔn)乘峋N和魔芋食酸菌（A.konjaci），同時(shí)，提出燕麥?zhǔn)乘峋N包括燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N、燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R亞種和燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N。然而，Schaad等[18]對(duì)該屬提出修訂，建議將燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R亞種和燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N應(yīng)該定義為細(xì)菌種，并增加水稻食酸菌（A.oryzae）為一個(gè)新的進(jìn)化分支。

根據(jù)2015 年Wiley 出版社和伯杰氏手冊(cè)基金會(huì)聯(lián)合出版的《伯杰古細(xì)菌和細(xì)菌分類手冊(cè)》描述，食酸菌屬包含7 個(gè)種和3 個(gè)亞種，代表種為敏捷食酸菌。根據(jù)食酸菌屬進(jìn)化分類地位可以分為兩組，一組包含敏捷食酸菌、德氏食酸菌、德弗食酸菌（A.defluvii）和中等食酸菌，這些存在于土壤、水和臨床的分離物中；另一組包括對(duì)植物有致病力的燕麥?zhǔn)乘峋⒛в笫乘峋突T食酸菌（A.anthurii）[12]。

2.2 病原菌形態(tài)特征及生長(zhǎng)條件

燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，單菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓形、半透明、淺黃色，菌落直徑大小約2～3 mm；菌落低凸、濕潤(rùn)光滑、邊緣纓邊形或圓鋸齒狀[6]。該菌細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，末端圓鈍，1.60μm×0.70μm，具有單極鞭毛，偶爾有2～3 根單極鞭毛，能游動(dòng)，單生，偶有串成鏈狀，不形成芽孢，無隔膜[6]。在30℃的培養(yǎng)條件下，第3天菌落直徑達(dá)到0.5～3 mm，第7天菌落直徑達(dá)到4 mm。燕麥?zhǔn)乘峋蠖鄶?shù)菌種在營養(yǎng)瓊脂上不產(chǎn)生色素，但是一些植物病原菌株可以產(chǎn)生黃色至微褐色的可擴(kuò)散性色素[16,19]。在培養(yǎng)基上，此菌的生長(zhǎng)溫度范圍為30℃～35℃[12]，致死溫度為51℃～52℃[8]。

2.3 甘蔗赤條病菌基因組特性

目前，美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫公布的燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N基因組序列共有18條，其中模式菌株ATCC 19860 具有完成圖，另外17 個(gè)株系基因組僅為框架圖或精細(xì)圖[20-22]，以上這些菌株的基因組序列大小為5.48～5.75 Mb，GC 含量為59.9%～68.8%，預(yù)測(cè)編碼基因有2 659～5 118 個(gè)，已注釋蛋白為2 542～4 706個(gè)。Fontana等[21]對(duì)侵染甘蔗的燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N菌株T10_61進(jìn)行了基因組測(cè)序和序列分析，結(jié)果顯示基因組序列為有5.65 Mb，GC含量為68.7%，編碼大約5 096 個(gè)基因，已注釋蛋白為4 829個(gè)，編碼58個(gè)tRNA；該菌株染色體上有3個(gè)rRNA操縱子和43個(gè)tRNA。

3 病原鑒定與檢測(cè)

通過田間癥狀來診斷甘蔗赤條病容易造成誤診，因?yàn)橛杉t蒼白草螺菌（Herbaspirillum rubrisubalbicans）[23]、黃單胞桿菌（Xanthomonassp.）[4,24]、鏈格孢菌（Alternariasp.）[25]也會(huì)引起甘蔗葉片出現(xiàn)紅色或紅褐色的條紋，類似甘蔗赤條病葉條斑癥狀。病害診斷還可以通過病原形態(tài)電鏡觀察、生化測(cè)試、血清學(xué)反應(yīng)以及多種分子檢測(cè)方法。常規(guī)PCR、巢式PCR、熒光定量PCR 等技術(shù)已應(yīng)用于該病害檢測(cè)。Zia-ul-Hussnain 等[26]從巴基斯坦甘蔗赤條病病株上分離得到了Aaa病菌，并分析了該病菌的菌體形態(tài)、培養(yǎng)條件和生理生化特性。Song 等[27]建立病菌生物學(xué)培養(yǎng)和巢式PCR 相結(jié)合的BIO-PCR 方法，對(duì)64 份水稻種子Aaa病菌進(jìn)行檢測(cè)，比常規(guī)PCR 檢出率高出29.7%。Fontana 等[4]利用靶向燕麥?zhǔn)乘峋腎TS 區(qū)域引物（Oaf1 和Oar1）和靶向細(xì)菌16S rRNA 通用引物（Plb/Mlb和P0f/P6r）對(duì)甘蔗赤條病樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。我們課題組根據(jù)燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎NITS區(qū)域設(shè)計(jì)一套巢式檢測(cè)引物對(duì)國內(nèi)甘蔗赤條病樣品也開展病害Aaa檢測(cè)[28]，隨后，利用內(nèi)測(cè)引物（RSD-ITS-F1 和RSD-ITS-R1）對(duì)84份有疑似赤條病癥狀的樣品和24份無癥狀的樣品分別進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測(cè)，檢出率為96%和83%[1]。此外，還開發(fā)了一套TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR 快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)100 拷貝[29]。有關(guān)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）檢測(cè)技術(shù)在甘蔗赤條病上的應(yīng)用未見報(bào)道[30]。

4 病原菌遺傳變異

關(guān)于侵染甘蔗的Aaa遺傳多樣性研究報(bào)道較少。Fontana 等[4]利用RAPD-PCR 技術(shù)分析了39 個(gè)來自阿根廷的甘蔗赤條病菌的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些分離物具有豐富的DNA 多態(tài)性圖譜，可分成4 種不同的類群，與分離物的地理來源有一定的相關(guān)性。最近，F(xiàn)ontana 等人[31]采用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（Multilocus sequence typing,MLST）進(jìn)一步研究阿根廷甘蔗赤條病菌的遺傳多樣性，來自4 個(gè)阿根廷蔗區(qū)的15 種株系存在5種核苷酸序列類型?；?42條甘蔗赤條病菌的ITS間隔區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，我國蔗區(qū)甘蔗赤條病菌株系序列存在高度的遺傳多樣性，ITS 間隔區(qū)序列長(zhǎng)度存在明顯的差異，主要是由于不同的插入/缺失（InDel）所致；這些分離物序列存在7種類型[1]。

5 燕麥?zhǔn)乘峋虏C(jī)理

目前有關(guān)于燕麥?zhǔn)乘峋N的致病機(jī)理研究報(bào)道較少，國內(nèi)學(xué)者對(duì)水稻細(xì)菌性褐條病的病原菌水稻食酸菌致病機(jī)理有了系統(tǒng)研究。Liu 等[32]通過蛋白質(zhì)譜分析并結(jié)合生物信息學(xué)方法，探究水稻食酸菌RS-1 株系的致病機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了病原菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)影響其致病性。劉賀[33]進(jìn)一步研究該病原菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的某些基因功能，發(fā)現(xiàn)icFm和dotU基因的缺失突變會(huì)導(dǎo)致水稻食酸菌RS-1 株系致病能力大大下降，而且icFm和dotU之間存在相互作用；另外，還發(fā)現(xiàn)病原菌菌毛中的重要基因pilp在其致病性、游動(dòng)能力、菌毛形成和生物膜形成等方面也發(fā)揮重要作用。當(dāng)pilp基因缺失后，細(xì)菌喪失菌圈和Ⅳ型菌毛，但是，當(dāng)該基因回補(bǔ)到突變菌體時(shí)，細(xì)菌再次形成暈圈，再次長(zhǎng)出菌毛。Masum 等[34]通過基因片段插入、缺失和互補(bǔ)分析方法研究Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）對(duì)水稻食酸菌RS-2株系的致病性，并使用同源重組法構(gòu)建25 個(gè)T6SS突變體與野生型（RS-2）之間進(jìn)行毒力比較，結(jié)果顯示，有15個(gè)T6SS基因突變體顯著降低了細(xì)菌的毒力以及減少了HCP 蛋白的分泌，表明T6SS 在菌株RS-2 的毒力中起著重要作用，主要原因可能是由于HCP 蛋白分泌減少和生物膜的形成等因素導(dǎo)致。

Brigida 等[35]基于轉(zhuǎn)錄組水平分析甘蔗響應(yīng)Aaa的分子機(jī)制，結(jié)果表明，在受Aaa侵染的轉(zhuǎn)錄本中，共有789 個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其中有723 個(gè)被注釋，對(duì)應(yīng)467 個(gè)基因；將獲得的差異基因通過GO 和KEGG 富集分析顯示這些基因參與了幾種代謝途徑，如蛋白質(zhì)編碼的應(yīng)激反應(yīng)、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程、氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等；同時(shí)，在ET 和JA-PRR 生物合成途徑中的基因、氧化爆裂基因、NBS-LRR基因、細(xì)胞壁強(qiáng)化基因、SAR誘導(dǎo)基因和致病相關(guān)基因（PR）顯著上調(diào)，因此這些基因都有可能積極參與甘蔗響應(yīng)Aaa侵染的防御作用。

6 甘蔗赤條病防控技術(shù)

選育和推廣甘蔗抗病品種是甘蔗赤條病防控最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施，也是一種綠色生態(tài)防控技術(shù)[6-8]。我國蔗區(qū)目前種植的甘蔗品種新臺(tái)糖16 號(hào)、新臺(tái)糖25 號(hào)、粵糖93-159、粵糖00-236、桂糖94-116、桂引5 號(hào)、云蔗03-194 在自然條件下有發(fā)病的現(xiàn)象，但是他們的抗病性需要進(jìn)一步接種鑒定[9,36]，通過田間的調(diào)查研究以及赤條病的接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)云蔗03-194 和閩糖11-610 為感病品種，福農(nóng)38、福農(nóng)39、桂糖29、桂糖31、粵糖60、粵糖55、云蔗05-51、柳城05-136、新臺(tái)糖20號(hào)、新臺(tái)糖22號(hào)等為抗病品種。

另外，還要采取多種農(nóng)業(yè)防治措施進(jìn)行綜合防控甘蔗赤條病。如：搞好農(nóng)田基本建設(shè)，建立合理的排灌系統(tǒng)；及時(shí)清除蔗田病株病葉，最好堆肥或集中燒毀，減少病害侵染源；適當(dāng)增施磷、鉀肥，促使植株健壯，增強(qiáng)抗病能力，降低發(fā)病率。化學(xué)藥劑防治也是有效控制甘蔗赤條病發(fā)生和流行的重要技術(shù)措施。在甘蔗赤條病發(fā)病初期，可用72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑750～1 000倍液或50%代森鋅1 000 倍稀釋液噴霧，每周一次，連續(xù)噴2～3次[36]。

7 展望

甘蔗是我國主要的糖料作物，是影響我國國計(jì)民生的四大農(nóng)產(chǎn)品之一，廣西和云南1 Mhm2（1 500 萬畝）蔗區(qū)已列入國家重要農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)保護(hù)區(qū)[37]。目前我國甘蔗赤條病在國內(nèi)各主要蔗區(qū)有零星發(fā)生，個(gè)別種植感病品種的田塊發(fā)生率較高，該病害的綜合防控應(yīng)該引起重視。加快甘蔗抗病育種的進(jìn)程，選育高產(chǎn)高糖抗病甘蔗新品種，為蔗區(qū)甘蔗品種多系布局提供依據(jù)；加強(qiáng)甘蔗野生種質(zhì)抗性基因的挖掘，拓寬國內(nèi)的甘蔗親本雜交遺傳基礎(chǔ)，通過有性雜交導(dǎo)入抗性遺傳物質(zhì)也值得深入探索。有報(bào)道甘蔗印度種、中國種種質(zhì)材料比較抗病[1,8]。雖然近年來有關(guān)甘蔗赤條病的病原分離鑒定、分子檢測(cè)以及致病菌的遺傳多樣性已有報(bào)道，但是有關(guān)甘蔗赤條病菌的致病機(jī)理及其與寄主的分子互作機(jī)制尚不清楚。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，容易獲得細(xì)菌全基因組的序列信息，可以在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、比較基因組學(xué)層面上，通過生信分析技術(shù)和手段探究細(xì)菌的耐藥性、毒力因子、代謝系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)性、進(jìn)化與演變歷程等。也可以開展病原菌侵染后的甘蔗轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)，探索甘蔗赤條病菌生態(tài)適應(yīng)性、致病性基因的分子進(jìn)化規(guī)律、病原菌的致病分子機(jī)理等基礎(chǔ)理論研究。