魏麗芳，梅余琪，鄒立思，劉訓(xùn)紅，陳佳麗，談夢(mèng)霞，王程成，蔡芷辰，林麗群

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)，收載于2015年版《中國藥典》，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功效，用于治療癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒等癥[1]。研究表明，連翹主要含有苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類等多元活性成分[2]。其中，苯乙醇苷類成分具有抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗內(nèi)毒素[7]及保肝[8]等作用；木脂素類成分具有抗炎[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]及保肝[12]等作用；黃酮類和酚酸類成分具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等作用[13-16]。中藥療效的發(fā)揮是多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，建立連翹中多種藥效成分同時(shí)測(cè)定的方法，對(duì)于探討多指標(biāo)成分的綜合評(píng)價(jià)體系具有實(shí)用性和有效性。

目前，關(guān)于連翹藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究多以少數(shù)幾個(gè)活性成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，尚少見對(duì)多元活性成分同時(shí)測(cè)定的研究報(bào)道。2015年版《中國藥典》以連翹酯苷A和連翹苷為質(zhì)控指標(biāo)，然而，單一或少數(shù)幾個(gè)活性成分的含量難以客觀反映中藥的整體質(zhì)量[17]。文獻(xiàn)報(bào)道的連翹藥材中成分分析的方法有高效液相色譜法(HPLC)[18-19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[20-21]等。但上述方法僅測(cè)定連翹藥材中含量較高的幾個(gè)成分，較難客觀反映連翹藥材的整體質(zhì)量。HPLC法難以有效分離極性相似的組分，且存在分析時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低等缺點(diǎn)，不能很好地滿足檢測(cè)需求[22]。三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(QTRAP-MS/MS)兼具三重四極桿質(zhì)譜的多種掃描功能以及線性離子阱質(zhì)譜的多級(jí)質(zhì)譜打碎能力，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)可根據(jù)分子量和碎片質(zhì)量的不同使色譜行為相似的物質(zhì)得到完全分離，并可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)化合物的定量分析，大大縮短了分析時(shí)間[23]。此外，線性離子阱可將離子聚焦于一條線上，與三維離子阱相比，增加了離子的存儲(chǔ)量，使儀器靈敏度得到提高[24]。因此，LC-QTRAP-MS/MS具有高選擇性、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，適合于中藥等復(fù)雜體系的組分分離分析。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了連翹藥材提取條件，基于超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定連翹中苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類共21種活性成分含量的方法。該方法可在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種成分的分離分析，使同分異構(gòu)體達(dá)到基線分離，有效提高了檢測(cè)通量和檢測(cè)速度，且能夠檢測(cè)藥材中的痕量和超痕量組分，可為連翹藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-MS系統(tǒng)：Shimadzu SIL-20A XR 超快速液相色譜儀，包括LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)；AB QTRAP 5500 三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源和Analyst 1.5.2軟件(美國AB SCIEX 公司)。 Q-500B高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)；BSA224S型電子分析天平(感量萬分之一)、ME36S型電子分析天平(感量百萬分之一)購于德國賽多利斯公司；湘儀H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；KQ-500B超聲波清洗機(jī)(超聲功率500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

對(duì)照品：連翹酯苷A(批號(hào)lw18012502，下同)、連翹酯苷B(lw180210050)、連翹苷(lw18012210)、松脂醇(lw171207150)購自南京良緯生物技術(shù)有限公司；連翹酯苷I(S23N7D25441)、牛蒡子苷(R12O8F45507)、對(duì)香豆酸(15S4)、阿魏酸(H27J7L16718)、橙皮苷(P06D9F77001)、木犀草素(C24M8Q36543)、連翹脂素(Z04J9X62808)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；松脂醇-β-D-葡萄糖苷(151205)購自成都克洛瑪生物科技有限公司；蘆丁(0080-9705)、沒食子酸(110831-200302)、黃芩苷(110715-200514)、紫云英苷(11092001)購自中國藥品生物制品檢定所；槲皮素(100081-201509)、木犀草苷(111720-201408)、咖啡酸(110885-200102)、山奈酚(110861-201310)購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸(20160701)購自寶雞市辰光生物科技有限公司；經(jīng)HPLC測(cè)定，上述化合物的純度均大于98%。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

連翹原藥材實(shí)地采集于國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)，商品藥材購自藥材公司，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為木犀科(Oleaceae)植物連翹Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)。樣品信息見表1。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

表1 連翹藥材樣品信息Table 1 The sample information of Forsythiae Fructus

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品適量，加72%甲醇配制成對(duì)照品貯備液，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷B、連翹酯苷I、蘆丁、對(duì)香豆酸、連翹酯苷A、木犀草苷、阿魏酸、松脂醇-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、橙皮苷、黃芩苷、連翹苷、牛蒡子苷、木犀草素、山奈酚、松脂醇和連翹脂素的質(zhì)量濃度分別為985、1 000、990、1 075、985、990、2 018、5 060、1 000、1 235、1 100、1 170、1 885、976、1 015、1 025、985、1 004、1 006、1 180、990 μg/mL。取各對(duì)照品貯備液適量，加72%甲醇定容至5 mL配成混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的工作溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，置于4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備取過50目篩的連翹果實(shí)粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入19 mL 72%甲醇，密閉，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用72%甲醇補(bǔ)足失重，過濾。濾液以12 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋10倍，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：XBridge ? C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈；梯度洗脫：0～0.01 min，2% B；0.01～6.5 min，2%～23% B；6.5～10.0 min，23%～24% B；10.0～14.0 min，24%～45% B；14.0～16.0 min，45%～55% B；16.0～17.0 min，55%～2% B；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子化源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；離子源溫度(TEM)：550 ℃；噴霧電壓(IS)：正離子模式下為4 500 V，負(fù)離子模式下為-4 500 V；氣簾氣(CUR)流速：40 L/min；霧化氣(GS1)流速：55 L/min；輔助氣(GS2)流速：55 L/min；接口加熱，全程通入氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品制備方法的優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)由于提取溶劑、液料比及提取時(shí)間會(huì)對(duì)藥材的提取效率造成影響，實(shí)驗(yàn)采用液相色譜法對(duì)藥典指標(biāo)成分連翹酯苷A和連翹苷的含量進(jìn)行檢測(cè)，以其提取率作為響應(yīng)值，對(duì)提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇)、液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g)及提取時(shí)間(15、30、45、60 min)進(jìn)行了單因素考察(見圖1)。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為30%～70%時(shí)，連翹酯苷A、連翹苷的提取率及總提取率均隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈上升趨勢(shì)，繼續(xù)增大甲醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降。料液比及提取時(shí)間對(duì)提取率的影響均為隨著因素水平的增大而增大，但料液比達(dá)到35∶1 mL/g、提取時(shí)間達(dá)到45 min后，三者的提取率增速較慢。綜合考慮溶劑消耗和提取率，選擇70%甲醇作提取溶劑、液料比為35∶1 mL/g，超聲提取45 min。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)及提取時(shí)間(C)對(duì)連翹脂苷A、連翹苷提取率的影響Fig.1 Effects of methanol volume fraction(A)，liquid to material ratio(B) and extraction time(C) on extraction rates of forsythiaside A and phillyrinphillyrin;forsythiaside A;total

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型建立根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素，應(yīng)用Box-Behnken中心組合方法[25]進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以連翹酯苷A和連翹苷的提取率總和(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得多元線性回歸方程為Y=-31.153+0.402A+1.428B+0.034C-2.625×10-3AB-6.167×10-4AC+1.267×10-3BC-1.863×10-3A2-0.017B2-2.122×10-4C2。

對(duì)該模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)(表3)。結(jié)果表明，該模型F值為30.42(P<0.000 1，模型極顯著)，而失擬項(xiàng)的F值為2.38(P=0.210 8>0.05，不顯著)，表明該方程的擬合較好且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各考察因素對(duì)響應(yīng)值影響的程度為A>B>C，總體上因素A、B、C、A2、B2以及交互項(xiàng)AB均顯著影響連翹酯苷A和連翹苷的提取率。

表3 響應(yīng)曲面方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and significant test for response surface

**P≤0.01 is extremely significant;*P≤0.05 is significant

根據(jù)回歸方程繪制不同影響因素對(duì)連翹酯苷A和連翹苷總提取率的響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的響應(yīng)曲面較陡，表示其交互作用對(duì)連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響顯著，而甲醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面較平滑，影響較小，與表3方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素間交互作用對(duì)連翹酯苷A及連翹苷提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface diagram of interaction between various factors on extraction efficiencies of forsythiaside A and phillyrin

2.1.3 模型驗(yàn)證利用Design-Expert 8.0.6對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到最優(yōu)的提取條件：甲醇體積分?jǐn)?shù)為71.24%，液料比為37.81∶1 mL/g，提取時(shí)間為60 min，提取率預(yù)測(cè)值為11.53%。為便于實(shí)驗(yàn)操作，將上述條件修正為甲醇體積分?jǐn)?shù)72%，液料比38∶1 mL/g，提取時(shí)間60 min。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得平均提取率為11.41%，與理論值的相對(duì)誤差為1.04%，說明該提取條件參數(shù)可靠，因此選其作為連翹藥材的提取條件。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化比較了SynergiTMHydro-RP 100?柱(2.0 mm×100 mm，2.5 μm)和XBridge?C18柱(4.6 mm× 100 mm，3.5 μm)對(duì)21種目標(biāo)成分的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果差別不大，但后者所得色譜響應(yīng)略高且色譜峰形更對(duì)稱，因此選擇XBridge ? C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)作為分離柱。分別考察了水-甲醇、水-乙腈、水(含0.1%甲酸)-乙腈組成的流動(dòng)相體系對(duì)21種目標(biāo)化合物色譜行為的影響。結(jié)果表明，以水(含0.1%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，21種目標(biāo)物能獲得較好的色譜峰形、分離效果和檢測(cè)靈敏度。因此，選擇水(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動(dòng)相。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別將質(zhì)量濃度為100 ng/mL(連翹酯苷I、連翹酯苷A、連翹脂素為1 μg/mL)的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示，紫云英苷、連翹苷、牛蒡子苷在正離子模式下有較強(qiáng)的離子響應(yīng)，其他成分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值更高。進(jìn)而對(duì)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描(子離子掃描)，得到離子碎片信息和二級(jí)質(zhì)譜圖,然后對(duì)解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子對(duì)的強(qiáng)度達(dá)到最佳。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表4，MRM色譜圖見圖3。

表4 21種目標(biāo)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 4 MS/MS parameters of 21 constituents

圖3 21種目標(biāo)成分混合對(duì)照溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of 21 constituents in reference solutionthe peak numbers denoted were the same as those in Table 4

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限精密吸取“1.2.1”中系列濃度的對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品溶液各2 μL，按“1.3”色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并以最小二乘法進(jìn)行線性回歸。分別以信噪比S/N≈3和S/N≈10時(shí)各對(duì)照品的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，21種目標(biāo)成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)不小于0.999 0，檢出限為0.001～233.710 ng/mL，定量下限為0.002～771.250 ng/mL。

2.3.2 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性精密吸取同一混合對(duì)照品溶液(各成分質(zhì)量濃度約為10 μg/mL)2 μL，在1天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣 分析6 次，計(jì)算得21種目標(biāo)成分日內(nèi)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～4.0%；每天進(jìn)樣3針，連續(xù)3天進(jìn)樣分析，計(jì)算得日間峰面積的RSD為2.8%～4.0%(表6)，說明儀器精密度良好；取同一連翹樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按“1.2.2”制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算得21種目標(biāo)成分峰面積的RSD為1.4%～4.0%(表6)，表明該方法重復(fù)性良好；取同一連翹供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算得21種目標(biāo)成分峰面積的RSD為1.8%～4.0%(表6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表5 21種化合物的線性關(guān)系、檢出限和定量下限Table 5 Linear relations,limits of detection and limits of quantitation of 21 constituents

2.3.3 加標(biāo)回收率取已測(cè)知含量的連翹樣品0.25 g(各9份)，精密稱定，分別加入低、中、高3個(gè)水平(80%、100%、120%)的對(duì)照品適量，每個(gè)水平3份，按“1.2.2”制備加標(biāo)回收供試品溶液，并按本方法進(jìn)行測(cè)定，得到21種目標(biāo)成分的平均回收率為98.6%～102%，RSD為0.89%～3.8%(表6)。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好，符合定量分析要求。

表6 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率結(jié)果(%)Table 6 Precisions,repeatabilities,stabilities and recoveries of 21 constituents(%)

2.4 樣品含量的測(cè)定

將表1中的樣品按“1.2.2”制成供試品溶液，取2 μL按本方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)相應(yīng)的線性關(guān)系計(jì)算供試品溶液中21種目標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表7、圖4。結(jié)果表明，所分析的連翹樣品中，連翹酯苷A的含量均大于0.25%，連翹苷的含量均大于0.15%，均符合2015年版《中國藥典》要求。其中，以苯乙醇苷類成分的含量最高，占總質(zhì)量濃度的69.51%～82.85%，木脂素類成分的含量次之，黃酮類及酚酸類成分的含量較低。不同產(chǎn)地和商品藥材中21種活性成分的含量存在一定差異，21種成分的總量以山西產(chǎn)藥材樣品(S2、S3、S4)最高，其中苯乙醇苷類、木脂素類成分的總量均以山西樣品(S2 、S3、S4)最高，這與連翹藥材的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)相吻合。說明連翹藥材的品質(zhì)形成可能受產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境、藥材采收加工等諸多因素的綜合影響。

表7 連翹中21種目標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果(n=3，μg/g)Table 7 Determined results of 21 constituents in Forsythiae Fructus(n=3，μg/g)

*the compound numbers denoted were the same as those in Table 4;**not detected

圖4 連翹中4類目標(biāo)成分含量的柱狀堆積圖Fig.4 Columnar stacked diagram of 4 types of target constituents in Forsythiae Fructus

3 結(jié) 論

本文針對(duì)連翹多種藥效成分的特點(diǎn)，用響應(yīng)面法優(yōu)化了樣品提取條件，建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同時(shí)測(cè)定連翹中苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類共21種活性成分含量的方法，并對(duì)連翹不同產(chǎn)地及商品藥材進(jìn)行比較分析。本方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，實(shí)現(xiàn)了包括痕量組分在內(nèi)的多元活性成分的同時(shí)測(cè)定，可為連翹藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供參考依據(jù)。