李苗苗 張家韜 崔傳斌 孫光軍 王東坤 崔志燕 高強(qiáng) 馮超 王鳳龍 陳德鑫 王曉強(qiáng)

摘 ?要：為明確貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）GY1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GY10和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GY12的生防特性，采用平板試驗(yàn)法、對(duì)扣法、盆栽試驗(yàn)等，對(duì)三株生防菌的抑菌譜、次生代謝產(chǎn)物、揮發(fā)性物質(zhì)、根際定殖能力和促生能力等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，GY1、GY10、GY12培養(yǎng)液可以顯著促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)和煙株的生長(zhǎng);三株生防菌抑菌譜廣，對(duì)煙草赤星病菌、黑脛病菌及花生鐮刀菌等9種病原具有顯著的抑制作用，并且都具有分泌嗜鐵素和蛋白酶的能力;三株生防菌發(fā)酵上清液和揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌（Alternaria alternata）和煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）具有顯著抑制作用;菌株的分泌蛋白熱穩(wěn)定性好，對(duì)煙草赤星病菌具有顯著的體外抑菌活性，并對(duì)酸性環(huán)境具有較高的耐受性;根際定殖結(jié)果表明，GY1-GY10-GY12復(fù)配與單菌株相比能增加各生防菌在煙草根際的定殖。以上結(jié)果對(duì)于菌株GY1、GY10、GY12生防特性的深入挖掘和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;煙草黑脛病;煙草赤星病;生防特性;根際定殖

Abstract： In order to clarify the biocontrol characteristics of Bacillus velezensis GY1， Bacillus amyloliquefaciens GY10， and Bacillus subtilis GY12， antibacterial spectrum， secondary metabolites， volatile substances， rhizosphere colonization ability and growth-promoting ability of the strains were studied by compatible test， double petri dish assay and pot test. The results showed that GY1， GY10， and GY12 can significantly promote seed germination and growth of tobacco. The three strains have a broad antimicrobial spectrum and have significant inhibitory effects against Alternaria alternata， Phytophthora parasitica var. nicotianae and Fusarium spp. In addition， all of the tree strains have the ability to produce siderophore and protease. The fermentation supernatants and volatile substances of the three strains also have a significant inhibitory effect against A. alternata and P. parasitica var. Nicotianae. The secreted proteins of the strains have good thermal stability and significant in vitro antibacterial activity on A. alternata， and have high tolerance to acid environments. The results of rhizosphere colonization assay indicated that GY1-GY10-GY12 compounding could increase the colonization of each biocontrol bacteria in the tobacco rhizosphere compared with a single strain. The resuls from this study provide guidance for in-depth exploration of the biocontrol characteristics of strains GY1， GY10， and GY12 and the industrial development of biocontrol strains.

Keywords： Bacillus spp.; Phytophthora parasitica; Alternaria alternata; biocontrol mechanism; rhizosphere colonization

生物防治是利用有益微生物或其代謝產(chǎn)物對(duì)植物病害進(jìn)行防治的技術(shù)，因其具有綠色、安全、防效持久，不污染環(huán)境等特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逐漸被應(yīng)用。煙草生育期內(nèi)會(huì)被很多病害侵染，如由煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的煙草黑脛病及由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的煙草赤星病[1-2]。目前，生產(chǎn)上對(duì)該類病害的防控主要依靠化學(xué)藥劑，但是長(zhǎng)期大量施用會(huì)對(duì)環(huán)境以及人類健康造成嚴(yán)重危害，因此生物防治成為煙草病害防控的重要措施之一[3]。生防細(xì)菌在生物防治中表現(xiàn)出巨大潛力，尤其是芽孢桿菌（Bacillus spp.）已被廣泛應(yīng)用于植物病害的防控。

芽孢桿菌在自然界分布廣泛，其繁殖速度快，環(huán)境適應(yīng)能力和抗逆能力強(qiáng)，是當(dāng)前生防產(chǎn)品中使用最廣泛的一種生防菌。目前應(yīng)用于生物防治的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等[4]。芽孢桿菌拮抗植物病害的機(jī)理有兩方面：一是對(duì)病原菌的直接抑制作用，包括競(jìng)爭(zhēng)作用、抗生作用、產(chǎn)生胞外酶和溶菌作用等[5];二是增強(qiáng)植物自身抵御病原菌入侵的能力[6]，如分泌促生物質(zhì)、激發(fā)誘導(dǎo)抗性等。關(guān)于利用芽孢桿菌防治植物病害的研究有很多報(bào)道，張鐸等[7]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BSD-2有較寬的抑菌譜，對(duì)棉花黃萎病等10種植物病菌有顯著抑制作用。解淀粉芽孢桿菌CPA-8產(chǎn)生的揮發(fā)物質(zhì)能夠抑制核果褐腐菌（Monilinia laxa）和灰葡萄孢（Botrytis cinera）菌絲的生長(zhǎng)[8]。鄭小亮等[9]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Zl-2抑菌蛋白可以使禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)畸形、抑制孢子萌發(fā)。MYO等[10]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）NKG-2產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體能抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等多種病原真菌生長(zhǎng)，同時(shí)可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶等抑菌物質(zhì)，并通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）和鐵載體促進(jìn)番茄生長(zhǎng)。

芽孢桿菌的生防效果與其根際定殖能力密切相關(guān)，生防菌株發(fā)揮作用的第一步就是要建立起一定的種群密度[11]。尹淑麗等[12]研究表明枯草芽孢桿菌BSD-2發(fā)酵液能提高土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量，降低可培養(yǎng)真菌的數(shù)量;楊洪鳳等[13]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌CC09能夠在小麥根組織的皮層細(xì)胞、細(xì)胞間隙、中柱鞘及髓腔中定殖，對(duì)小麥赤霉病防效達(dá)到90.3%。以往對(duì)根際定殖的研究主要以單一菌株為主，對(duì)復(fù)配菌株，尤其是復(fù)配菌株在煙草根際定殖趨勢(shì)的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)室以煙草疫霉菌為靶標(biāo)病原從煙株根際土壤分離獲得三株生防芽孢桿菌，分別為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）GY1、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）GY10以及枯草芽孢桿菌（B. subtilis）GY12。前期的研究發(fā)現(xiàn)，三株生防菌對(duì)煙草疫霉菌均有較好的抑制作用，且三者復(fù)配后對(duì)煙草疫霉菌的抑制效果顯著高于單一菌株[14]。因此本研究進(jìn)一步明確了三株生防菌對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響及三菌株復(fù)配對(duì)煙株的促生作用;并以煙草疫霉菌及鏈格孢菌為供試病原，對(duì)三株生防菌的揮發(fā)性氣體、抑菌物質(zhì)、根際定殖情況等進(jìn)行了研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?供試煙草品種、病原及生防菌株 ?供試煙草品種紅花大金元，供試病原煙草疫霉菌1號(hào)生理小種、煙草鏈格孢菌，供試生防菌GY1、GY10、GY12，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?NA、NB、PDA培養(yǎng)基購(gòu)于海博生物;OA培養(yǎng)基;CAS鑒定培養(yǎng)基[15];蛋白酶鑒定培養(yǎng)基[16]。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?菌株培養(yǎng)及發(fā)酵液制備 ?從?80 ℃冰箱中取出生防菌GY1、GY10、GY12，在不含抗生素的NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落后，分別用無(wú)菌牙簽挑取單菌落轉(zhuǎn)移至NB液體培養(yǎng)基中，150 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)，獲得各菌株培養(yǎng)液。

1.2.2 ?生防菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)和煙株生長(zhǎng)的影響 ?（1）種子萌發(fā)試驗(yàn)：分別收集過(guò)夜培養(yǎng)的GY1、GY10、GY12培養(yǎng)液，4000×g離心5 min收集菌體，棄上清。用無(wú)菌水進(jìn)行重懸，分別調(diào)節(jié)GY1、GY10、GY12菌懸液OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9，煙草種子消毒后分別用不同濃度的菌懸液浸泡30 min，以無(wú)菌水浸泡為對(duì)照。在培養(yǎng)皿里鋪雙層無(wú)菌濾紙，用2 mL無(wú)菌水浸濕后將100顆煙草種子均勻點(diǎn)在濾紙上，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤(rùn)，每隔12 h觀察、統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況。（2）促生試驗(yàn)：離心收集過(guò)夜培養(yǎng)的GY1、GY10、GY12菌體并用無(wú)菌水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液OD600為0.1，三株生防菌按照體積比1∶1∶1進(jìn)行混合，煙株移栽20 d及40 d時(shí)每株20 mL復(fù)配菌液灌根，60 d后測(cè)量比較處理與CK（無(wú)菌水）株高、莖圍、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、根冠比的差異，參照YC/T 142—1998《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》。促生率=100%×（處理?對(duì)照）/對(duì)照

1.2.3 ?生防菌株抑菌譜測(cè)定 ?測(cè)試病原菌有棉花立枯病、黃瓜枯萎病、花生鐮刀菌枯萎病、葡萄炭疽病、番茄晚疫病、煙草赤星病、小麥赤霉病、馬鈴薯枯萎病病菌和煙草疫霉菌等9種病原菌，分別接種于PDA平板中心，在距離平板中心2.5 cm處均勻打4個(gè)孔，分別加OD600為0.1的GY1、GY10、GY12菌懸液和無(wú)菌水50 μL，將平板轉(zhuǎn)移至28 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d左右，觀察抑菌效果。

1.2.4 ?菌株發(fā)酵上清液對(duì)煙草疫霉菌、鏈格孢菌的抑制作用 ?分別用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾GY1、GY10、GY12發(fā)酵上清液，將無(wú)菌過(guò)濾液置于4 ℃冰箱備用;將直徑8 mm的煙草疫霉菌或鏈格孢菌菌餅接至OA或PDA平板中央，距平板中心2.5 cm處對(duì)稱打兩個(gè)孔，每孔加入50 μL無(wú)菌過(guò)濾液，以無(wú)菌水為對(duì)照，將平板轉(zhuǎn)移至28 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，測(cè)量各處理菌落直徑，檢驗(yàn)無(wú)菌過(guò)濾液抑菌效果。抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.5 ?菌株產(chǎn)生嗜鐵素和蛋白酶的能力 ?將10 μL菌懸液分別點(diǎn)在CAS培養(yǎng)基和蛋白酶鑒定培養(yǎng)基中央，鑒定方法參照CAS鑒定培養(yǎng)基法[15]，蛋白酶鑒定培養(yǎng)基法[16]。

1.2.6 ?菌株揮發(fā)性氣體對(duì)煙草疫霉菌、鏈格孢菌的抑制作用 ?參照王靜等[17]培養(yǎng)皿對(duì)扣熏蒸法。

1.2.7 ?溫度和pH對(duì)菌株抑菌蛋白穩(wěn)定性的影響 ?采用硫酸銨沉淀法（70%飽和度）分別提取GY1、GY10、GY12菌株粗蛋白，將蛋白分別在25、40、60、80 ℃處理30 min后采用平板對(duì)峙法（同1.2.3）測(cè)定其對(duì)鏈格孢菌的抑制作用。分別調(diào)節(jié)蛋白pH為3、4、5、6、7、8、9、10和11放入4 ℃冰箱保存，24 h后用鹽酸和氫氧化鈉將pH調(diào)至8.0后測(cè)定蛋白對(duì)鏈格孢菌的抑制作用，以無(wú)菌水為對(duì)照。

1.2.8 ?根際定殖情況 ?采用抗生素標(biāo)記法[18]，分別將GY1標(biāo)記氨芐青霉素抗性，GY10標(biāo)記利福平抗性，GY12標(biāo)記鏈霉素抗性（標(biāo)記濃度均為150 μg/mL）。收集過(guò)夜培養(yǎng)經(jīng)抗生素標(biāo)記的GY1、GY10、GY12培養(yǎng)液，4000×g離心5 min收集菌體，棄上清。用無(wú)菌水進(jìn)行重懸，分別調(diào)節(jié)GY1、GY10、GY12菌懸液OD600為0.1。共設(shè)置GY1、GY10、GY12、GY1-GY10、GY1-GY12、GY10-GY12、GY1-GY10-GY12等7個(gè)處理（復(fù)配組合按等比例混合），每株煙草20 mL菌懸液灌根。在1、5、10、15、30、60 d每處理分別取根際土1 g，置于10 mL 0.85% NaCl溶液中振蕩30 min，梯度稀釋后涂布于相應(yīng)的抗生素（150 μg/mL）平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算各處理中三菌株定殖數(shù)量。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?三株生防菌對(duì)煙草種子萌發(fā)和煙株生長(zhǎng)的影響

2.1.1 ?種子萌發(fā)試驗(yàn) ?如圖1A所示，用CK（無(wú)菌水）及OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY1菌懸液處理煙草種子后第6天，萌發(fā)率分別為45.33%、48.00%、51.00%、52.67%、66.00%及58.33%;5個(gè)濃度的菌懸液均能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，且OD600為0.3、0.5、0.7、0.9時(shí)種子萌發(fā)率與CK相比均有顯著差異（p<0.05）;OD600為0.7對(duì)煙草種子萌發(fā)最有利，相較于CK提高了20.67百分點(diǎn)。

如圖1B所示，用CK及OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY10菌懸液處理煙草種子后第6天，萌發(fā)率分別為45.33%、46.33%、63.00%、65.67%、40.33%及33.33%;菌懸液OD600為0.1、0.3、0.5時(shí)均能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，且與CK相比均有顯著差異（p<0.05）;OD600為0.5對(duì)煙草種子萌發(fā)最有利，相較于CK提高了20.34個(gè)百分點(diǎn);OD600為0.7、0.9時(shí)萌發(fā)率低于CK。

如圖1C所示，用CK及OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY12菌懸液處理煙草種子后第6天萌發(fā)率分別為45.33%、46.33%、56.67%、60.67%、60.00%及54.33%;5個(gè)濃度的菌懸液均能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，且OD600為0.3、0.5、0.7、0.9時(shí)種子萌發(fā)率與CK相比均有顯著差異（p<0.05）;OD600為0.5時(shí)對(duì)煙草種子萌發(fā)最有利，相較于CK提高了15.34百分點(diǎn)。

2.1.2 ?促生試驗(yàn) ?促生結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)復(fù)配菌GY1-GY10-GY12灌根后株高、莖圍、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及根冠比與CK相比均有顯著提高（p<0.05），促生率分別為14.01%，22.75%，77.19%，83.14%和14.29%，說(shuō)明復(fù)配菌具有促生作用。

2.2 ?三株生防菌抑菌譜

如圖2所示，GY1、GY10、GY12對(duì)棉花立枯病、黃瓜枯萎病、花生鐮刀菌枯萎病、葡萄炭疽病、番茄晚疫病、煙草赤星病、小麥赤霉病、馬鈴薯枯萎病等多種真菌病害的病原菌都有一定的抑制作用。

2.3 ?菌株發(fā)酵上清液對(duì)煙草疫霉菌、鏈格孢菌的抑制作用

如圖3所示，GY1無(wú)菌過(guò)濾液對(duì)煙草疫霉菌有抑制作用，抑菌率為65%，而GY10、GY12無(wú)菌過(guò)濾液對(duì)煙草疫霉菌沒(méi)有抑制作用;GY1、GY10、GY12無(wú)菌過(guò)濾液對(duì)鏈格孢菌有較好的抑制作用，抑菌率均達(dá)到60%以上，分別為71.79%、67.50%、61.07%，與CK（無(wú)菌水）相比均有顯著差異（p<0.05），其中GY1無(wú)菌過(guò)濾液的抑制效果最好。

2.4 ?菌株揮發(fā)性氣體對(duì)煙草疫霉菌及鏈格孢菌的抑制作用

對(duì)扣試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，GY1、GY10、GY12揮發(fā)性氣體對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，抑菌率分別為57.98%、55.95%、57.50%，菌絲生長(zhǎng)變?nèi)?，與CK（無(wú)菌水）有顯著差異（p<0.05），但三者之間差異不顯著。GY1、GY10、GY12揮發(fā)性氣體對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，抑菌率分別為63.78%、73.33%、76.22%，菌絲生長(zhǎng)變?nèi)酰cCK有顯著差異，同時(shí)GY10、GY12抑菌效果較好，與GY1有顯著差異。

2.5 ?菌株產(chǎn)生嗜鐵素和蛋白酶的能力

如圖5所示，GY1、GY10、GY12在CAS平板上都產(chǎn)生了黃色暈圈，表明三菌株都能產(chǎn)生嗜鐵素，其中GY10黃色暈圈直徑最大;GY1、GY10、GY12在蛋白酶平板上均產(chǎn)生透明圈，表明三株菌都能夠分泌蛋白酶。

2.6 ?溫度和pH對(duì)生防菌株抑菌蛋白穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，GY1蛋白在25、40、60、80 ℃， 4個(gè)溫度下處理后與鏈格孢菌對(duì)峙，菌落直徑與CK（無(wú)菌水）相比均有顯著差異（p<0.05，下同）;40、60 ℃處理時(shí)鏈格孢菌菌落直徑分別為1.47及1.57 cm，與25 ℃（室溫）相比差異不顯著，80 ℃處理時(shí)鏈格孢菌菌落直徑為1.73 cm，與25 ℃處理相比差異顯著。GY1蛋白在4個(gè)溫度處理后抑菌率都在50%以上。GY10蛋白在25、40、60、80 ℃，4個(gè)溫度下處理后與鏈格孢菌對(duì)峙，菌落直徑與CK（無(wú)菌水）相比均有顯著差異，抑菌率都在50%以上。GY12蛋白經(jīng)不同溫度處理后仍然具有較強(qiáng)的抑菌能力，與對(duì)照（6.73 cm）相比差異顯著，但是隨著溫度升高，抑菌能力略有下降（抑菌率分別為52.48%、48.51%、42.57%、41.58%），但差異不顯著。

如圖7所示，GY1蛋白經(jīng)pH 3～11過(guò)夜處理后恢復(fù)pH至8.0與鏈格孢菌對(duì)峙，各處理菌落直徑與CK（無(wú)菌水）相比均有顯著差異，pH在3～10范圍內(nèi)抑菌率均在50%以上。當(dāng)pH為8時(shí)菌落直徑最小，為1.5 cm，抑菌率最高，為59.79%;隨著pH降低或升高，鏈格孢菌落直徑均呈逐漸增大趨勢(shì)。當(dāng)pH升高至11時(shí)菌落直徑為2.23 cm，抑菌率最低，為40.13%，與其他處理有顯著差異。

如圖8所示，GY10蛋白經(jīng)pH 3～11過(guò)夜處理后恢復(fù)pH至8.0與鏈格孢菌對(duì)峙，各處理菌落直徑與CK（無(wú)菌水）相比均有顯著差異;當(dāng)pH為8時(shí)菌落直徑最小，為1.8 cm，抑菌率最高，為51.74%;隨著pH降低或升高，鏈格孢菌落直徑均呈逐漸增大趨勢(shì)。當(dāng)pH升高至10和11時(shí)菌落直徑分別為3.07 cm和3.00 cm，抑菌率較低分別為17.78%和19.57%，與其他處理有顯著差異。pH在3～9范圍內(nèi)抑菌率均在40%以上。

如圖9所示，GY12蛋白經(jīng)pH 3～11過(guò)夜處理后恢復(fù)pH至8.0與鏈格孢菌對(duì)峙，各處理抑菌能力與空白對(duì)照均差異顯著;pH為8時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，菌落直徑為3.07 cm，抑菌率為54.46%;隨著pH降低和升高，其抑菌活性均呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì);當(dāng)pH為11時(shí)抑菌活性最弱，抑菌率下降至19.80%，與其他處理差異顯著。

2.7 ?根際定殖情況

如圖10A所示，隨時(shí)間推進(jìn)，GY1根際定殖量在GY1-GY10、GY1-GY12、GY10-GY12、GY1-GY10-GY12 四個(gè)處理中均呈現(xiàn)先下降，5 d左右上升，后又下降的趨勢(shì)，30 d定殖量為（1.62～2.01）×106 cfu/g，且GY1-GY10-GY12處理中GY1的定殖量相對(duì)于其他處理高;如圖10B所示，GY10根際定殖量總體呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，15～30 d趨于平穩(wěn)，30 d定殖量為（0.65～0.93）×106 cfu/g，且GY1-GY10-GY12處理中GY10的定殖量在15、30 d時(shí)均高于其他處理。如圖10C所示，GY12根際定殖量變化趨勢(shì)不穩(wěn)定，總體呈現(xiàn)先下降第5天再略上升后又下降的趨勢(shì)，30 d定殖量為（0.52～0.63）×106 cfu/g。總體上三株生防菌在煙草根際的定殖趨勢(shì)基本一致。

3 ?討 ?論

生物防治是植物病害防控的重要措施，生防細(xì)菌是一類重要的生防資源。由于具有較強(qiáng)的環(huán)境脅迫耐受性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力和抗菌活性，芽孢桿菌是市場(chǎng)上商品化應(yīng)用最廣泛的生防菌株。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）GY1、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）GY10以及枯草芽孢桿菌（B. subtilis）GY12對(duì)棉花立枯病等多種病原菌具有顯著的抑制作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，GY1、GY10、GY12均能產(chǎn)生嗜鐵素以及蛋白酶等抑菌物質(zhì)，這與戴秀華等[19]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌Lx-11通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素等抗菌物質(zhì)抑制植物病原真菌的結(jié)果是相似的。黃娜等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的分泌蛋白對(duì)供試的6種植物病原真菌具有抑制作用，該蛋白在80 ℃處理30 min后仍有抑菌作用，在pH 4～7仍保持一定的抑菌活性。本研究也發(fā)現(xiàn)，GY1、GY10和GY12粗蛋白對(duì)鏈格孢菌具有顯著的抑制作用，且對(duì)高溫（80 ℃，30 min）及酸性具有較強(qiáng)的耐受性，尤其是GY1和GY10粗蛋白在pH下降至3時(shí)抑菌率仍在40.0%以上。釋放揮發(fā)性有機(jī)物也是生防微生物的一種生防機(jī)制。王靜等[17]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌AR03產(chǎn)生的揮發(fā)物對(duì)煙草疫霉菌和鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有不同程度的抑制和致畸作用。本研究中，GY1、GY10、GY12產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可以顯著抑制煙草疫霉菌以及鏈格孢菌菌絲的生長(zhǎng)和擴(kuò)張。上述結(jié)果對(duì)于疫霉菌和鏈格孢菌的防控提供了新的菌種資源。

促進(jìn)植物生長(zhǎng)是生防菌的一個(gè)重要特性。研究中我們發(fā)現(xiàn)，利用GY1、GY10、GY12發(fā)酵液浸泡煙草種子可以顯著促進(jìn)種子的萌發(fā)，推測(cè)菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可能分泌一些生長(zhǎng)素類物質(zhì)，該結(jié)果與之前報(bào)道的煙草促生試驗(yàn)結(jié)果是一致的[14]。目前利用生防菌開(kāi)展促生防病的研究多數(shù)以單一菌株為主[21]，利用多菌株復(fù)配進(jìn)行防病促生試驗(yàn)的研究較少，本試驗(yàn)通過(guò)將三株不同類型的生防芽孢桿菌復(fù)配進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三株生防菌發(fā)酵后混合灌根能顯著促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)，株高、莖圍、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根冠比等與CK相比顯著提高。

土壤中微生物類群的豐富程度可以較敏感地反映土壤中生化反應(yīng)的方向和強(qiáng)度[22]，生防菌能否在作物根際有效定殖是發(fā)揮作用的前提和關(guān)鍵[23]，王勇等[24]研究表明蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156處理辣椒60 d后，在辣椒根際土壤中仍然能夠檢測(cè)到菌株的存在，說(shuō)明AR156在辣椒根圍具有較好的定殖能力。本研究表明，GY1、GY10、GY12均能夠在煙株根際良好定殖，而且研究中首次發(fā)現(xiàn)GY1-GY10- GY12復(fù)配與各菌株單獨(dú)處理相比，復(fù)配后可以提高各菌株在根際的定殖能力，表明多菌株復(fù)配相對(duì)于單一菌株在根際定殖更具優(yōu)勢(shì)，推測(cè)原因是三株生防菌相容性好，相互之間競(jìng)爭(zhēng)、抑制作用弱，且三株生防菌具有不同的系統(tǒng)分類地位，生長(zhǎng)代謝及對(duì)養(yǎng)分的需求存在差異，復(fù)配后菌株間的相互作用以及代謝物質(zhì)增強(qiáng)了各菌株對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性。該研究為生防菌劑的復(fù)配開(kāi)發(fā)及高效利用提供了思路。

4 ?結(jié) ?論

芽孢桿菌GY1、GY10、GY12抑菌譜廣，對(duì)棉花立枯病、黃瓜枯萎病等9種病原菌具有抑制作用;三株生防菌的發(fā)酵上清液、揮發(fā)性有機(jī)物、粗蛋白均可抑制煙草疫霉菌和鏈格孢菌的生長(zhǎng)。三株生防菌的粗蛋白對(duì)高溫具有強(qiáng)的耐受性，且都對(duì)pH不敏感。促生及根際定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，GY1、GY10、GY12菌懸液?jiǎn)为?dú)浸泡煙草種子可以促進(jìn)種子的萌發(fā)，將三株生防菌復(fù)配后灌根不僅能促進(jìn)煙株生長(zhǎng)還能提高菌株的根際定殖能力。上述結(jié)果表明，芽孢桿菌GY1、GY10、GY12具有非常好的生防應(yīng)用及開(kāi)發(fā)前景。

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