黎妍妍 王林 彭五星 陳守文 楊勇 李錫宏

摘 ?要：通過大田試驗和ITS擴增子測序技術，研究了解淀粉芽孢桿菌不同施用方式[兌水灌根（DS）、拌土圍根（BT）、米糠+拌土圍根（MK+BT）]對煙株根際土壤真菌群落的影響，旨在為解淀粉芽孢桿菌的科學施用提供理論基礎。結果表明，BT和MK+BT均可顯著提高煙株根際土壤真菌群落OTU數(shù)量及Sobs、Shannon、Chao1指數(shù)，對煙株根際土壤真菌群落結構具有顯著影響，提高了土壤中子囊菌門和擔子菌門的相對豐度，促使土壤中毛殼屬（Chaetomium）、木霉屬（Trichoderma）和赤霉菌屬（Gibberella）等一些有益微生物比例上升。綜合來看，在改善根際土壤真菌群落的作用中，MK+BT>BT>DS。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;施用方式;真菌群落;多樣性

Abstract： The research aims to provide a theoretical basis for the reasonable application of Bacillus. amyloliquefaciens. Field experiments and ITS amplicon sequencing were conducted to explore the effects of three application methods of B. amyloliquefaciens on improving the fungal community in tobacco rhizosphere soil. The three application methods included the followings： （1）diluted with water and then irrigated into tobacco rhizosphere （DS）， （2）mixed with soil and then applied around tobacco rhizosphere （BT）， （3） mixed with rice bran and soil， then applied around tobacco rhizosphere （MK+BT）. Results showed that the treatment of BT and MK+BT could significantly improve the OTU number and the Sobs， Shannon， Chao 1 indexes of soil fungal community. Meanwhile， BT and MK+BT can also significantly promote the structure of soil fungal community， improve the relative abundance of fungal phyla （Ascomycota， Basidiomycota）， and increase the proportion of beneficial fungal genera （Chaetomium， Trichoderma， Gibberella）. In conclusion， the promotion tendency of three application methods of B. amyloliquefaciens on fungal community in tobacco rhizosphere soil was shown as MK+BT>BT>DS.

Keywords： Bacillus amyloliquefaciens; application methods; fungal community; diversity

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類在植物根際穩(wěn)定存活，且可促進植物生長及其對礦質營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1]。相較于傳統(tǒng)的化肥施用，PGPR對環(huán)境友好，且可持續(xù)凈化和修復土壤、防控土傳病害等。因此，PGPR作為一種微生物肥料越來越受到人們關注[2]。在目前研究較多的PGPR中，芽孢桿菌屬（Bacillus）是重要的一類，其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）通過產生細菌素[3]、伊草枯菌素[4]、寡肽[5]等次級代謝產物和生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸和亞精胺等多種生理活性物質[6]，促進番茄[6]、水稻[7]、茶葉[8]、煙葉[9]等作物生長，修復土壤生態(tài)環(huán)境，提高作物抗病抗逆性。然而，由于土壤環(huán)境的復雜性，外源微生物通常很難在土壤中定殖并發(fā)揮促生作用。因此，研究認為在PGPR的使用上加以改進是有效發(fā)揮其作用的方法之一[10]。然而，目前關于解淀粉芽孢桿菌施用方式的報道甚少，尤其是在植煙土壤的施用方式上報道尚為空白。

土壤微生物群落結構反映土壤質量[11]。在土壤微生物中，真菌對土壤環(huán)境的變化比細菌更敏感[12]，它參與土壤物質轉化、養(yǎng)分循環(huán)和能量轉化過程，促進土壤團聚體形成，進而改善土壤結構[13]。因此，分析土壤真菌群落結構響應外界環(huán)境的變化，對于探尋更為適宜的解淀粉芽孢桿菌施用方式具有重要意義。本研究擬通過田間小區(qū)試驗和ITS擴增子測序技術，探究解淀粉芽孢桿菌的不同施用方式在改善煙株根際土壤真菌群落中的作用，旨在為進一步提升解淀粉芽孢桿菌的促生效果提供科學依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

所使用的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株為YH-22[14]，按相關工藝進行發(fā)酵，并干燥為粉劑（1.0×1010 cfu/g）;米糠為市售。

1.2 ?試驗地點及試驗設置

試驗于2018年在湖北省恩施州宣恩縣羅圈巖開展，土壤類型為黃棕壤，基礎理化性質：pH 6.25，有機質2.81%，堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為112.43 mg/kg、22.74 mg/kg和344.51 mg/kg;烤煙品種為云煙87。

試驗設置5個處理，各處理隨機區(qū)組排列，3次重復，小區(qū)面積為39.6 m2、種植烤煙60株，行株距為1.2 m×0.55 m。各處理分別為：CK1，清水對照，50 mL/株;CK2（MK），米糠拌土圍根，按照m米糠：m土=3∶50混勻，圍根施用，100 g/株;DS（兌水灌根），按照m菌劑∶m水=1∶500混勻，灌根施用，50 mL/株;BT（拌土圍根），按照m菌劑∶m土=1∶1000混勻，圍根施用，100 g/株;MK+BT（米糠+拌土圍根），按照m菌劑∶m米糠∶m土=1∶60∶940混勻，圍根施用，100 g/株。其中MK+BT處理先將菌劑和米糠噴水均勻混合，在20～25 ℃溫度條件下發(fā)酵20～25 d，然后拌土圍根。各處理分別于煙株移栽時和移栽后40 d各施一次，每次施用量相同。

1.3 ?煙株根際土壤樣品采集

煙株移栽后100 d時，在每小區(qū)中采集5株煙

株（生長發(fā)育一致）的根際土壤樣品。用取樣鏟完整挖出煙株根系，敲落與根系結合較松的土壤后，用細刷刷落與根系結合較緊密的土壤（4 mm內）至自封袋中，即為根際土壤。將每小區(qū)5株煙株的根際土壤充分混合為一個樣品。共計15個土樣。土樣采集后置于干冰中帶回實驗室，放置于–80 ℃冰箱保存，用于DNA提取。

1.4 ?土壤真菌群落分析

1.4.1 ?DNA提取及PCR擴增 ?按照FastDNA Spin Kit試劑盒（MP Biomedicals， USA）的說明提取土樣總DNA。以ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′）和ITS2-2043R（5′-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3′）為引物對真菌ITS1區(qū)進行PCR擴增。擴增體系（30 ?L）為：15 ?L Phusion Master Mix Buffer（2×），3 ?L引物（2 μmol/L），10 ?L DNA（1 ng/μL）模板，2 ?L H2O。反應程序為：98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30個循環(huán)）;72 ℃ 5 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物合格后進行文庫構建，在Illumina Hiseq PE250測序平臺進行上機測序（諾禾致源生物信息科技有限公司）。

1.4.2 ?OTU聚類與物種注釋 ?對所有樣品的Effective Tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類為OTUs（Operational Taxonomic Units）。對OTUs代表序列進行物種注釋，用Qiime軟件（Version 1.9.1）中的blast方法與Unit數(shù)據(jù)庫進行真菌物種注釋分析（設定閾值為E-value=10-5），獲得各分類水平上的群落組成。

1.5 ?數(shù)據(jù)處理

利用R軟件繪制真菌群落的稀釋曲線圖。利用Mothur軟件計算α多樣性指數(shù)（Sobs、Chao1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)）。基于加權Unifrac距離，利用Qiime軟件對門分類水平上土壤真菌群落的組成進行UPGMA聚類分析。利用IBM Statistics SPSS 22.0軟件中的One-way ANOVA分析真菌群落OTU數(shù)量、α多樣性指數(shù)、物種相對豐度等在各處理間的差異（p<0.05水平），結果以平均值±標準誤差表示。根據(jù)樣品在屬水平上的物種注釋信息及相對豐度，對其豐度進行標準化處理（樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標準差所得到的值），并采用HemI軟件繪制Heatmap圖。

2 ?結 ?果

2.1 ?根際土壤測序深度評估

以真菌有效序列數(shù)為橫坐標，以OTU數(shù)量為縱坐標繪制了土壤真菌群落稀釋曲線（圖1）。圖1表明，在97%相似度的OTUs分類水平下，OTU數(shù)量在測序量增加的初始階段呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢;隨著測序量的不斷增加，OTU數(shù)量趨于平緩，表明測序數(shù)量基本合理，可反映土壤真菌群落絕大多數(shù)序列信息。

2.2 ?土壤真菌群落多樣性和豐富度分析

對根際土壤真菌群落多樣性和豐富度進行了One-way ANOVA方差分析（表1）。結果表明，土壤真菌群落OTU數(shù)量、Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)均以MK+BT處理最高，分別較其他處理高出14.67%～249.47%、17.59%～282.71%、5.95%～142.80%和10.93%～270.76%;其中，MK+BT與BT間無顯著差異，但均顯著高于其他處理，表明BT和MK+BT處理可顯著提升煙株根際土壤真菌群落多樣性和豐富度，尤以MK+BT處理增幅明顯。

2.3 ?門水平上土壤真菌群落組成分析

2.3.1 ?土壤主要真菌門相對豐度分析 ?對各處理土壤中主要真菌門的相對豐度進行了分析（表2）。子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）和隱真菌門（Rozellomycota）在各處理土壤中分別占19.49%～43.36%、12.77%～51.43%、0.11%～5.70%、0.14%～3.16%、0.03%～1.95%和0.00%～0.31%。CK1和CK2（MK）中被孢霉門的相對豐度最高，而DS、BT和MK+BT處理中子囊菌門的相對豐度最高。

在這6個真菌門中，壺菌門和擔子菌門的相對豐度在各處理間存在顯著差異。DS、BT和MK+BT處理中擔子菌門的相對豐度較CK1和CK2均有所增加，其中BT和MK+BT中擔子菌門相對豐度顯著高于其他處理，以MK+BT處理最高;而BT和MK+BT中壺菌門的相對豐度則顯著低于CK1和DS。

2.3.2 ?門水平上土壤真菌群落聚類分析 ?基于加權Unifrac距離，對各處理土壤真菌群落在門分類水平上進行了UPGMA聚類分析（圖2）。BT和MK+BT處理相似性較高，聚為一類;CK1和CK2相似性較高，聚為一類;DS處理單獨為一類。以上結果表明DS、BT和MK+BT處理對煙株根際土壤真菌群落組成均具有較大影響。

2.4 ?屬水平上土壤真菌群落組成分析

根據(jù)物種注釋信息和豐度信息，在屬分類水平上對各處理根際土壤主要真菌屬的相對豐度進行了分析（表3）。DS、BT、MK+BT和CK1、CK2中相對豐度>1%的真菌屬分別有2、8、4和4、2個。方差分析結果顯示，腐質霉屬（Humicola）、新赤殼屬（Neocosmospora）、團絲核菌屬（Papulaspora）、Boothiomyces、毛殼屬（Chaetomium）、彎孢屬（Curvularia）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉菌屬（Mucor）、木霉屬（Trichoderma）和赤霉菌屬（Gibberella）的相對豐度在各處理間存在顯著差異。與CK1相比，DS處理顯著降低了團絲核菌屬（Papulaspora）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）和毛霉菌屬（Mucor）的相對豐度，其他真菌屬無顯著差異;BT和MK+BT處理顯著降低了團絲核菌屬（Papulaspora）、Boothiomyces、短梗蠕孢屬（Trichocladium）和毛霉菌屬（Mucor）的相對豐度，但顯著提高了土壤中新赤殼屬（Neocosmospora）、毛殼屬（Chaetomium）和彎孢屬（Curvularia）的相對豐度;此外，BT處理也顯著提高了土壤中根霉屬（Rhizopus）和赤霉菌屬（Gibberella）的相對豐度，MK+BT處理顯著提高了土壤中木霉屬（Trichoderma）的相對豐度。

對各處理土壤樣本中這13個真菌屬的相對豐度相似性進行了聚類分析（圖3）。結果表明，BT和MK+BT處理相似性較高，聚為一類;而DS、CK1和CK2（MK）處理差異較大，分別單獨為一類。

3 ?討 ?論

微生物群落多樣性與其對脅迫的響應密切相關。微生物群落多樣性指數(shù)越高，其響應脅迫的修復能力也越強[15]。因此，健康煙田煙株根際土壤較土傳病害發(fā)病煙田具有更高的土壤真菌群落多樣性和豐富度[16]。在本研究中解淀粉芽孢桿菌的3種施用方式中，拌土圍根（BT）、米糠+拌土圍根（MK+BT）顯著提高了煙株根際土壤真菌群落的Sobs、Shannon和Chao1等多樣性和豐富度指數(shù)，其中尤以米糠+拌土圍根（MK+BT）提升效果最為顯著。因此，米糠+拌土圍根（MK+BT）更能提高煙株根際土壤真菌群落響應脅迫的修復能力。

在真菌門水平上，解淀粉芽孢桿菌的3種施用方式和對照根際土壤具有相似的優(yōu)勢真菌，但其相對豐度存在一定差異。兌水灌根（DS）、拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）提高了土壤中子囊菌門的相對豐度;且拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）顯著提高了土壤中擔子菌門的相對豐度。已有研究表明，子囊菌門和擔子菌門真菌有利于分解土壤中的纖維素、木質素等，促進土壤碳循環(huán)[17-18]。

在真菌屬水平上，拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）具有相似的根際土壤真菌群落結構，它們提高了土壤中新赤殼屬（Neocosmospora）、毛殼屬（Chaetomium）、彎孢屬（Curvularia）、根霉屬（Rhizopus）、赤霉菌屬（Gibberella）和木霉屬（Trichoderma）的相對豐度。已有研究發(fā)現(xiàn)，毛殼屬（Chaetomium）能夠產生多種抗生素（毛殼素、球毛殼素等），對大豆莖稈枯腐病菌（Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis）、西紅柿枯萎病菌（Verticillium dahliae）等多種土傳病原菌具有抑菌活性[19]。木霉屬（Trichoderma）可直接與根系相互作用，通過產生生物活性物質（細胞壁降解酶以及次生代謝產物等）促進植物生長，進而抵抗生物侵染和非生物脅迫[20]。赤霉菌屬（Gibberella）可分泌赤霉素，促進植物生長[9]。由此可見，拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）促使土壤中Chaetomium、Trichoderma、Gibberella等有益微生物比例上升，這些微生物增強了土壤的抑病性[16，21]。然而，值得注意的是，拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）同時可引起土壤中一些病原菌相對豐度的增加。據(jù)報道，新赤殼屬（Neocosmospora）中的N. vasinfecta可引起花生基腐病和大豆莖枯病[22]，根霉屬（Rhizopus）則可引起瓜果軟腐病，盡管目前并無這些病原菌侵染煙草的報道，但也應引起重視。

已有研究表明，液體接種物直接摻入土壤通常會導致外源細菌與土壤顆粒粘附，從而大大降低它們在土壤中的垂直運輸及其在植物根際定殖的能力[23]，本研究結果也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，如解淀粉芽孢桿菌兌水灌根（DS）對煙株根際土壤真菌群落的改善作用較小。一些載體材料的添加則能夠提高微生物的定殖能力和有效性[24-25]，本研究中使用的米糠一方面作為營養(yǎng)介質可為解淀粉芽孢桿菌提供持續(xù)的營養(yǎng)，使芽孢桿菌菌群在營養(yǎng)上處于優(yōu)勢，從而充分發(fā)揮促生作用;另一方面，米糠具有良好的孔隙結構，可為外源微生物提供空間保護，并改善土壤結構，進而使土壤環(huán)境更有利于微生物定殖[25-26]。因此，與兌水灌根（DS）和拌土圍根（BT）兩種施用方式相比，米糠+拌土圍根（MK+BT）的根際土壤真菌群落表現(xiàn)出了更高的多樣性和豐富度。

需要指出的是，本研究僅是黃棕壤土壤類型上1年的大田試驗結果，獲取的拌土圍根（BT）和米糠+拌土圍根（MK+BT）效果的廣適性和長效性還有待于進一步監(jiān)測。

4 ?結 ?論

本研究結果表明，與兌水灌根相比，解淀粉芽孢桿菌拌土圍根和與米糠一起發(fā)酵后再拌土圍根兩種施用方式均可顯著提高煙株根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度;提升土壤中子囊菌門和擔子菌門的相對豐度，促使土壤中毛殼屬（Chaetomium）、木霉屬（Trichoderma）和赤霉菌屬（Gibberella）等有益微生物比例上升，對煙株根際土壤真菌群落結構具有顯著的積極影響。

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