王傲晨，陳旭

（中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科，遼寧省口腔疾病重點實驗室，沈陽 110002）

再生醫(yī)學(xué)是一門研究如何促進創(chuàng)傷后組織再生及功能重建的新興學(xué)科，主要通過干細胞治療與組織工程來改善、修復(fù)或再生損傷組織。免疫反應(yīng)貫穿組織再生與修復(fù)的整個過程，并發(fā)揮雙刃劍作用。既可以早期促進創(chuàng)面關(guān)閉，確保受損組織得到及時保護，避免再度感染，又可以導(dǎo)致組織纖維化，形成影響解剖結(jié)構(gòu)和功能的瘢痕組織［1-2］。因此，維持再生微環(huán)境的免疫穩(wěn)態(tài)，是再生醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵。

間充質(zhì)干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于骨髓、脂肪、肌肉、臍帶和牙髓等多種組織中的多功能干細胞，除了具有自我更新和多向分化的潛能外，還具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。在慢性損傷的組織中，MSCs不僅具有直接分化再生組織的能力，而且可通過細胞與細胞直接接觸或旁分泌作用調(diào)節(jié)免疫細胞活性，維持局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［3］?；诿庖叻磻?yīng)在組織再生過程中的重要作用，以及MSCs對免疫細胞增殖、分化及功能的調(diào)節(jié)能力，MSCs已被廣泛應(yīng)用于組織再生和自身免疫性疾病的治療中。

目前，更多的證據(jù)傾向于MSCs通過旁分泌作用發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，其旁分泌物質(zhì)主要包括細胞外囊泡和細胞因子。外泌體直徑介于30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/mL，具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu)，透射電鏡下觀察具有典型的“杯口狀”形態(tài)，含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA和非編碼RNA等，在細胞間的通訊過程中起重要作用［4］。近年來研究［5］表明，MSCs來源的外泌體 （mesenchymal stem cells-derived exosomes，MSC-Exo） 與MSCs有著相似的功能，包括調(diào)節(jié)機體免疫，抑制過度的炎癥反應(yīng)和促進組織的修復(fù)與再生等。外泌體作用于靶細胞的途徑有3種:（1） 外泌體通過靶細胞胞吞作用被攝入到細胞內(nèi)或通過細胞膜融合的方式與靶細胞膜融合，直接釋放含有的活性物質(zhì)及信息到靶細胞；（2）外泌體膜蛋白可直接與靶細胞表面受體相結(jié)合，并激活細胞內(nèi)的信號通路，將細胞外信號傳遞到細胞內(nèi)，從而進行信息交流，這種信息傳遞方式同樣常見于免疫系統(tǒng)。例如，外泌體膜外蛋白乳脂肪球上皮生長因子8可以與樹突狀細胞和巨噬細胞表面的整合素結(jié)合，是外泌體與抗原提呈細胞識別的主要途徑；（3） 外泌體膜蛋白可被細胞外間隙的蛋白酶切割，裂解的片段可作為可溶性配體，與目標細胞表面受體結(jié)合，完成信息傳遞。

利用MSC-Exo替代MSCs治療自身免疫疾病和組織再生，逐漸成為研究的新熱點。本文將對MSCExo通過調(diào)節(jié)免疫促進組織再生的作用與機制研究進展進行綜述。

1 MSC-Exo通過調(diào)節(jié)巨噬細胞分化促進組織再生

大多數(shù)組織中存在巨噬細胞，但更多的巨噬細胞在組織損傷后被招募。除了發(fā)揮吞噬細胞碎片、侵入生物體、中性粒細胞和其他凋亡細胞的作用外，巨噬細胞還活躍調(diào)節(jié)組織的愈合過程。在組織微環(huán)境的作用下，巨噬細胞增殖并發(fā)生顯著的表型和功能變化。巨噬細胞包括2種類型，即促炎表型（M1型） 巨噬細胞和抗炎表型 （M2型） 巨噬細胞。在組織修復(fù)早期階段，活化的M1型巨噬細胞分泌活性氧和炎性細胞因子如白細胞介素 （interleukin，IL）-1β，IL-6和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factoralpha，TNF-α），產(chǎn)生高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合成 酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）［6］。這些細胞可殺傷微生物，清除碎片以及促進輔助性T細胞1 （T helper 1，Th1） 分化。而在修復(fù)過程后期，活化的M2型巨噬細胞表達IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1） 和甘露糖受體，并產(chǎn)生精氨酸酶代替iNOS，從而降低炎癥反應(yīng)，促進細胞增殖和組織再生［7］。因此，促進未極化的巨噬細胞向M2型極化有利于受損組織的修復(fù)與再生。

MSC-Exo的一個重要免疫調(diào)節(jié)特性是促進M2型巨噬細胞極化，增強抗炎細胞因子的表達，從而降低局部的炎性反應(yīng)。LO SICCO C等［8］發(fā)現(xiàn)，在正常和缺氧條件下培養(yǎng)的脂肪MSCs能夠釋放具有抗炎作用的外泌體，當其與巨噬細胞共培養(yǎng)時，可被有效內(nèi)化，在短期內(nèi)促進巨噬細胞增殖，并增強巨噬細胞由M1型向M2型極化；體內(nèi)實驗研究顯示，MSC-Exo可有效降低骨骼肌損傷小鼠的局部炎癥反應(yīng)，并增強肌源性標記物的表達，證實MSC-Exo具有調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的能力，在骨骼肌組織修復(fù)與再生中可能有潛在的應(yīng)用價值。另一項研究［9］發(fā)現(xiàn)，在免疫功能正常的大鼠中，人胚胎MSC-Exo可以促進軟骨細胞增殖和基質(zhì)合成，在軟骨缺損處M2型巨噬細胞浸潤較M1型巨噬細胞更多，同時炎性細胞因子IL-1β和TNF-α表達降低，從而促進軟骨修復(fù)；進一步體外研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo的CD73蛋白可誘導(dǎo)軟骨細胞中AKT和ERK的快速磷酸化，而這種磷酸化在誘導(dǎo)細胞遷移和增殖中起關(guān)鍵作用。應(yīng)用CD 73抑制劑傳遞信號可導(dǎo)致AKT和ERK磷酸化衰減，進一步證實了外泌體中CD73的作用。這些研究表明巨噬細胞在MSC-Exo介導(dǎo)的軟骨再生中發(fā)揮重要作用。此外，在高氧誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型中，MSC-Exo的局部輸入可促進周圍組織中M2型巨噬細胞極化，使組織中促炎細胞因子水平降低，重塑肺部微環(huán)境，減少組織纖維化和微血管喪失，同時改善肺功能［10］。因此，MSC-Exo可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化促進組織再生，為MSCs無細胞治療提供了基礎(chǔ)，但在進行臨床試驗之前仍需對MSC-Exo的作用機制進行深入研究。

2 MSC-Exo通過促進調(diào)節(jié)性T細胞 （regulatory T cells，Tregs） 轉(zhuǎn)化促進組織再生

隨著人們對特異性免疫，尤其是T細胞在組織再生調(diào)節(jié)作用中的認識逐漸深入，T細胞在再生微環(huán)境中的作用成為新的研究熱點。T細胞分為若干亞群如細胞毒性T細胞、Th1、Th2、Th17以及Tregs細胞等。其中，Tregs是一類具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+T細胞亞群，可分泌IL-4、IL-10、TGF-β等細胞因子，負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，并為巨噬細胞極化提供一個有利的抗炎微環(huán)境［11］。Tregs在骨骼、皮膚和心肌再生中的重要作用均已得到證實［12-13］。例如，在小鼠皮膚受損后，傷口早期聚集大量高度活化的Tregs，抑制了γ干擾素 （interferon-γ，IFN-γ） 的產(chǎn)生和M1型巨噬細胞的集聚，同時誘導(dǎo)表皮生長因子受體的表達，揭示了Tregs在促進皮膚傷口愈合中的作用［14］。另有研究［15］表明，活化的Tregs促進中性粒細胞分泌抗炎分子，包括IL-10和TGF-β和吲哚胺2，3-雙加氧酶，抑制中性粒細胞IL-6的產(chǎn)生，進而維持再生微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，間接促進組織再生。在腎缺血再灌注損傷模型中，Tregs通過分泌IL-10抑制中性粒細胞浸潤，有效減輕腎損傷［16］。而Th17是一類分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和TNF-α多種炎性細胞因子的T細胞亞群，與Tregs在分化和功能上相互抑制［17］。YI等［18］發(fā)現(xiàn)通過抑制脊髓損傷小鼠的Th17分化，可降低局部炎癥反應(yīng)，有利于脊髓的再生和功能恢復(fù)，功能性驗證了T細胞可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進組織再生。因此，Th17與Tregs的動態(tài)平衡是維持免疫微環(huán)境的關(guān)鍵，更是組織再生成功的前提。

MSC-Exo對T細胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)，是其維持免疫穩(wěn)態(tài)，促進組織再生的重要途徑之一。體外實驗發(fā)現(xiàn)，CD3/CD28雙抗體激活的CD4+T細胞可在TGF-β1和IL-2的誘導(dǎo)下向Tregs轉(zhuǎn)化，而在誘導(dǎo)體系中加入MSC-Exo后，Tregs比例顯著升高，說明MSC-Exo可促進Tregs轉(zhuǎn)化。而另有研究［19］證實，MSC-Exo不僅可誘導(dǎo)Th1細胞向Th2細胞的轉(zhuǎn)化，同時還抑制T細胞向Th17細胞的分化，說明MSC-Exo對T細胞轉(zhuǎn)化具有顯著的調(diào)控作用。在小鼠的皮膚移植實驗［20］中發(fā)現(xiàn)，人胚胎MSC-Exo可增加Tregs比例，并延遲移植物的排斥反應(yīng)；而在未接受皮膚移植的小鼠中，外泌體并不能使Tregs比例增加，這表明MSC-Exo誘導(dǎo)Tregs的轉(zhuǎn)化依賴于激活的免疫系統(tǒng)。此外，MSC-Exo也可被外周血中單個核細胞胞吞，通過上調(diào)IL-10和TGF-β1的表達水平，促進Tregs的增殖與轉(zhuǎn)化，從而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)［21］。LI等［22］發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo攜帶的鞘氨醇-1-磷酸可與CD4+T細胞表面鞘氨醇-1-磷酸受體1結(jié)合，并促進CD4+T細胞向Tregs轉(zhuǎn)化；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性輸入MSC-Exo可上調(diào)再生障礙性貧血小鼠外周血中Tregs/Th17比例，降低IL-17表達水平，并有效延緩疾病的進展。這些研究表明MSC-Exo可通過上調(diào)Tregs發(fā)揮免疫抑制作用，為組織再生提供適宜的微環(huán)境。

3 MSC-Exo通過微小RNA （microRNA，miRNA） 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進組織再生

外泌體作為一類內(nèi)源性微囊泡，是細胞間核酸及蛋白轉(zhuǎn)運的主要介質(zhì)，其中miRNA被認為是外泌體調(diào)控受體細胞的主要物質(zhì)。miRNA是一種由18～25個核苷酸組成的內(nèi)源性微小單鏈非編碼RNA分子，通過與靶基因中的堿基配對互補，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)節(jié)基因表達，最終導(dǎo)致靶基因的抑制或降解。外泌體含有多種miRNA，并可以通過轉(zhuǎn)運miRNA調(diào)控受體細胞的基因轉(zhuǎn)錄，影響受體細胞的生物學(xué)功能。2017年，有學(xué)者［23］發(fā)現(xiàn)骨髓MSCExo可以提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率，促進其軸突的再生；敲除miRNA發(fā)揮功能的關(guān)鍵協(xié)同蛋白Argonaute-2后，骨髓MSC-Exo對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞保護作用和軸突再生能力明顯降低，表明miRNA是骨髓MSC-Exo發(fā)揮神經(jīng)保護和再生作用的關(guān)鍵。另一項研究［24］顯示，脂多糖預(yù)處理的臍帶MSC-Exo，其外泌體攜帶的miRNA let-7b表達量升高；并且，let-7b可通過抑制TLR4/NF-κB通路和激活STAT3/AKT信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，從而促進創(chuàng)面愈合。

miRNAs可調(diào)節(jié)多達1/3的蛋白質(zhì)編碼基因，其在免疫反應(yīng)的不同階段均發(fā)揮作用，包括免疫細胞的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)，以及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和功能的維持［25］。雖然目前關(guān)于MSC-Exo中miRNA通過調(diào)控免疫促進組織再生的研究尚少，但隨著高通量測序技術(shù)的不斷成熟，miRNA表達譜分析將對MSC-Exo免疫調(diào)節(jié)和再生應(yīng)用的研究有更好的啟示作用。

綜上，MSC-Exo具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可通過增強M2型巨噬細胞的極化及Tregs轉(zhuǎn)化，抑制促炎細胞因子的表達，降低局部的炎癥反應(yīng)，從而促進組織再生。MSC-Exo作為一種無細胞制劑，既避免了干細胞治療的免疫排斥反應(yīng)，也不存在倫理爭議，在組織再生中體現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。而MSCExo在人體內(nèi)應(yīng)用的方式、劑量以及長期安全性還有待評估。隨著對MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)作用機制的研究深入，其對組織再生的作用與機制將更加清晰。