朱詩鳴 ，陳瑞琳，王真 *

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州310006）

高通量測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）又稱“二代測序技術(shù)”，是相對于第一代DNA測序技術(shù)而言的新型測序手段。1977年Sanger等[1]發(fā)明了雙脫氧核苷酸末端終止法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生。到目前為止，第一代測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究工作中，傳統(tǒng)的第一代測序技術(shù)具有高度準確性和簡單、快捷等優(yōu)點，但有測序反應(yīng)時間較長、測序通量低、成本高等缺點，僅適用于小樣本遺傳疾病基因的鑒定，難以完成沒有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查；隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和深入，我們迫切需要更高通量的核酸測序手段進行檢測[2]。基于此，第二代測序應(yīng)運而生。2005年Meyer等[3]報道了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)，開創(chuàng)了高通量測序技術(shù)的先河。

高通量測序技術(shù)具有通量高、敏感性高、價格低廉等優(yōu)勢，有較強的應(yīng)用前景，目前已廣泛應(yīng)用到遺傳病學(xué)、腫瘤標(biāo)志物檢測等多個方面。2014年Wilson等[4]報道了1例應(yīng)用高通量測序技術(shù)對腦脊液進行檢測，最終診斷為鉤端螺旋體感染，標(biāo)志著高通量測序技術(shù)對微生物檢測應(yīng)用的開始。近年來，高通量測序技術(shù)在微生物和感染性疾病的診斷中發(fā)揮了巨大作用，現(xiàn)將其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用作如下綜述。

1 高通量測序的優(yōu)勢

1.1 較廣的病原體檢測范圍

傳統(tǒng)微生物感染的確診主要依賴于臨床微生物實驗室的培養(yǎng)結(jié)果，但是受臨床采樣、培養(yǎng)條件和抗生素使用等影響，培養(yǎng)陽性率較低。假設(shè)驅(qū)動的分子檢測技術(shù)（例如PCR）只能針對特定目標(biāo)生物進行單獨檢測，稀有病原體遺漏和引物不匹配降低了其敏感性，而高通量測序技術(shù)對病原體的篩查是直接從樣本中獲得病原體的核酸序列信息，再通過生物信息學(xué)的方法對得到的序列進行比對分析?；谏飿颖編斓凝嫶?，其檢測方式?jīng)Q定該技術(shù)檢測范圍，涵蓋細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、螺旋體等典型或非典型病原體。高通量測序技術(shù)依靠其無偏倚、隨機的特性不僅可以檢測已知病原體的基因組，更可以從頭組裝未知微生物的基因組，后者對新發(fā)病原體感染鑒定發(fā)揮重要作用。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測呼吸道、神經(jīng)系統(tǒng)、血液、胃腸道及眼部等感染[5]。

Yun等[6]對ICU 78例血漿標(biāo)本同時進行高通量測序和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測，結(jié)果表明，在細菌及真菌方面，最終有8份標(biāo)本培養(yǎng)及測序均陽性，3份標(biāo)本培養(yǎng)陽性而測序陰性，9份標(biāo)本培養(yǎng)陰性而測序陽性。此外，通過二代測序還在14份血樣中檢測到15種病毒，且均通過第一代桑格法測序驗證。整體診斷靈敏度顯著增加。Yun等[7]對178例重癥肺炎患者采用高通量測序進行檢測，結(jié)果表明高通量測序可以提供更快速準確的病原學(xué)結(jié)果，能檢測出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)黑色普式菌等傳統(tǒng)培養(yǎng)較難檢測的細菌。臨床根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整了治療方案，患者28天和90天的生存率均有提高。

Yao等[8]首次報道了高通量測序技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)李斯特菌感染中的應(yīng)用，對3例進行了腦脊液檢測，其中2例腦干炎與1例腦膜炎，單核細胞增生性李斯特菌序列數(shù)范圍在74-665，覆蓋度為0.28%～2.4%，3例均通過了PCR或細菌學(xué)驗證，將NGS的臨床應(yīng)用拓展到中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌感染的診斷中。神經(jīng)囊蟲病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的寄生蟲病，但若缺乏特定的神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn)很難診斷，F(xiàn)ei等[9]收集分析7例腦脊液，通過高通量測序技術(shù)檢測出豬帶絳蟲，明確診斷了臨床上缺失病原學(xué)證據(jù)的病例。

侵襲性真菌感染往往發(fā)生在免疫力低下的人群中，其確診依靠活檢，而侵入性活檢對于免疫功能低下者感染風(fēng)險更高。Hong等[10]使用無細胞血漿測序技術(shù)無創(chuàng)檢測真菌感染患者的真菌DNA，該試驗從血漿中識別出身體各個部位的霉菌，顯示了無細胞血漿測序能夠整合來自許多器官的信息。

1.2 較快的檢測速度

根據(jù)使用試劑盒的不同，DNA文庫的制備最短只需2.5小時[11]，高通量測序技術(shù)具有能夠在短時間內(nèi)獲得病原體基因組的特點，在傳染病檢測中應(yīng)用較廣。傳染病傳變速度快，容易發(fā)生變化，高通量測序技術(shù)可以疾病初期從標(biāo)本中快速獲得病原體的全基因序列，準確快速地鑒定病原體性質(zhì)，分析其亞型，對溯源和后續(xù)治療都有很大的幫助。

茂海燕等[12]自2013年開始采用高通量測序技術(shù)，通過建立數(shù)據(jù)庫、測序及數(shù)據(jù)處理流程，實現(xiàn)了在收到標(biāo)本后3天左右快速獲得甲型流感病毒序列和亞型鑒定的結(jié)果，為應(yīng)對新型流感病毒突發(fā)疫情提供了技術(shù)。

2020年初SARS-COV-2病毒在全球范圍內(nèi)廣泛流行，同年4月，Pillay等[13]在南非應(yīng)用高通量測序技術(shù)，使用Nextera DNA flex試劑盒耗時不到3小時得到了該樣本的所有DNA片段，且基因測序成功率高達90.9%，它能夠為分析遺傳變異和鑒定傳播鏈提供快速準確的信息。該團隊利用不到3周的時間對108個樣本進行測序，完成了南非一次大規(guī)模COVID-19的數(shù)據(jù)生成和分析。Jary等[14]采集法國首例SARS-CoV-2感染患者的每日呼吸道樣本，運用高通量測序技術(shù)觀察病毒準種的改變，發(fā)現(xiàn)不同時間以及同一天不同解剖結(jié)構(gòu)的病毒存在變異，說明SARS-CoV-2在體內(nèi)表現(xiàn)為復(fù)雜而動態(tài)的變異分布。

1.3 精確預(yù)測耐藥基因組

高通量測序技術(shù)的重要優(yōu)勢是不依賴微生物藥敏實驗而能精準預(yù)測微生物的抗生素耐藥狀況[15]。多項研究表明，與第一代測序相比，高通量測序技術(shù)不僅可以確認第一代測序驗證的耐藥位點，還有助于檢測出抗生素耐藥基因出現(xiàn)的新發(fā)突變，并且通過進一步的實驗確定這些基因?qū)е驴股啬退幠Ｊ降脑颉Ｒ延醒芯勘容^了使用高通量測序技術(shù)和第一代測序方法檢測耐藥突變的區(qū)別，第一代測序法遺漏了至少一半由高通量測序技術(shù)鑒定出的耐藥突變，而這些突變已經(jīng)被證實與治療失敗的風(fēng)險相關(guān)[16]。高通量測序技術(shù)通過對轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒的檢測確定目前病原體耐藥的模式，隨著病原體耐藥性的蔓延，運用新一代技術(shù)在減輕當(dāng)前耐藥狀況以及預(yù)測新的耐藥機制中刻不容緩[17]。

耐藥結(jié)核是結(jié)核病防控工作中亟待解決的問題。雖然目前在結(jié)核分枝桿菌耐藥研究方面已取得了較大的進展，發(fā)現(xiàn)了許多與耐藥相關(guān)的基因及點突變，但許多耐藥現(xiàn)象仍有待深入闡釋。借助高通量測序技術(shù)和比較基因組學(xué)等方法大大提高了發(fā)現(xiàn)耐藥基因和突變位點的效率。近期研究發(fā)現(xiàn)[18]，Rv3792基因的同義SNP突變可增加下游基因embC表達，從而引起對乙胺丁醇的耐藥性增高，增加了對結(jié)核分枝桿菌耐藥機制的認識。在研究南非地區(qū)近期暴發(fā)的耐藥結(jié)核病傳播中，Ioerger等[19]通過對全基因組的比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)貜V泛耐藥結(jié)核菌是逐步獲得耐藥性而形成，并非直接廣泛耐藥結(jié)核進行傳播。在中國，通過對2株廣泛耐藥結(jié)核菌全基因組分析后也得出相似結(jié)論，認為廣泛耐藥菌株產(chǎn)生的原因是單個藥物耐藥逐步累積的結(jié)果[20]。

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）作為耐碳青霉烯腸桿菌（Carbapene-resistant enterobacteriaceae，CRE）中的重要組成部分，已成為全球?qū)用娴闹饕矄栴}之一，監(jiān)測和有效控制感染對于限制CRE的傳播至關(guān)重要。Giani等[21]發(fā)現(xiàn)，CRKP的傳播流行是通過復(fù)制高風(fēng)險碳青霉烯酶，例如產(chǎn)KPC型酶的ST258型菌株實現(xiàn)的。Fasciana等[22]通過高通量測序技術(shù)對25株耐碳青霉烯（CRKP）和25株易感性（Carbapenem susceptible Klebsiella Pneumoniae，CSKP）肺炎克雷伯菌菌株進行全基因組對比，發(fā)現(xiàn)CRKP中參與編碼β內(nèi)酰胺酶的基因中blaSHV、blaTEM、blaKPC、blaOXA 和 blaCTX-M 最頻繁，證明肺炎克雷伯菌對碳青霉烯藥物耐藥機制跟上述基因相關(guān)。隨著粘菌素的臨床重復(fù)使用，出現(xiàn)了由染色體和質(zhì)?？剐詸C制介導(dǎo)的耐大腸菌素的肺炎克雷伯菌株，Hadjadj等[23]通過測序老撾和泰國5種相關(guān)菌株，除廣泛報道的mcr-1基因外，首次發(fā)現(xiàn)mcr-3變體及mcr-8變體基因呈陽性且共現(xiàn)，說明在研究大腸菌素耐藥機制時應(yīng)監(jiān)測mcr基因的傳播和進化。

1.4 掌握病原體毒力

了解病原體的毒力能評估、預(yù)測疾病嚴重程度和轉(zhuǎn)歸，有助于選擇更有針對性的抗感染治療。產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希菌O104:H4型曾引發(fā)過大規(guī)模疫情，然而其已知的進化歷史和基因組多樣性等相關(guān)信息較少。Zhou等[24]使用高通量測序技術(shù)進行暴發(fā)和非暴發(fā)菌株系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，為其后續(xù)研究提供了進化背景，并揭示譜系特異性標(biāo)記。一項回顧性研究[25]通過對腫瘤患者血液艱難梭菌感染引起的腹瀉標(biāo)本的高通量測序，能夠得到跟毒力相關(guān)的基因，表明大多數(shù)感染是由于攜帶cdtAB的產(chǎn)毒菌株引起，雖然該基因的攜帶與死亡之間關(guān)系不明顯，但依然對臨床工作有參考價值。

白喉毒素（DT）是由人類病原體白喉棒狀桿菌以及人畜共患的潰瘍桿菌和假結(jié)核桿菌的產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的。產(chǎn)毒菌株可能導(dǎo)致嚴重的呼吸道白喉、心肌炎、神經(jīng)系統(tǒng)損害或皮膚白喉。Alexandra等[26]通過對137種產(chǎn)毒或非產(chǎn)毒性棒狀桿菌進行全基因組測序，分析其編碼白喉毒素的tox基因和白喉毒素抑制基因dtxR，總結(jié)為4種具有物種特異性的分支，對應(yīng)白喉桿菌、假結(jié)核桿菌、非典型潰瘍桿菌和潰瘍桿菌，從而識別出不同棒狀桿菌的亞群。而與白喉桿菌中噬菌體不同，僅存在于潰瘍桿菌中的致病島也說明了不同人畜共患疾病的菌株之間的毒性傳播途徑可能有所不同，以至于可能使其產(chǎn)生新的致病潛力。

2 典型病例

患者，男，72歲，農(nóng)民，因“反復(fù)干咳胸悶氣急發(fā)熱6月余”于2020年8月25日于浙江省中醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院?；颊呒韧泄撬柙錾惓＞C合征病史，主要表現(xiàn)為粒系、紅系增生低下，否認特殊職業(yè)史及接觸史，否認吸煙史。查體：體溫38℃，脈搏 106次/分，呼吸 25次/分，血壓 106/69mmHg。雙肺呼吸音粗糙，右下肺聞及濕啰音，未及哮鳴音，口唇粘膜蒼白，余無明顯異常。輔助檢查：WBC 8.3×109/L，Hb 67g/L，PLT 183×109/L，CRP 64.7mg/L，PCT 0.254ng/mL，ESR 32mm/L。胸部 CT 示：兩肺散在團片狀及結(jié)節(jié)狀高密度影?；颊吆粑啦≡瓩z測、結(jié)核菌抗體實驗未見明顯異常。入院診斷:肺炎，骨髓異常增生綜合征。

患者入院后予頭孢唑肟抗感染、化痰平喘、升白細胞及輸注紅細胞等對癥治療，予莫西沙星等抗感染效果不佳，發(fā)熱原因及肺部病灶病理性質(zhì)不明，于2020年8月26日行纖維支氣管鏡檢查，見兩肺支氣管黏膜蒼白，管腔內(nèi)分泌物較多，白呈泡沫狀，于左下肺基底段行肺泡灌洗送檢NGS及G、GM實驗，X-pert，培養(yǎng)及真菌涂片檢查。肺泡灌洗液G實驗+內(nèi)毒素：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖 186.6pg/mL，革蘭氏陰性菌脂多糖＞2.500EU/mL。X-pert培養(yǎng)及真菌涂片均未見異常。NGS結(jié)果提示卡式肺孢子菌感染。根據(jù)相關(guān)輔檢結(jié)果予卡泊芬凈50mg，靜脈滴注，1次/d及復(fù)方磺胺甲惡唑片1.44g口服，1次/6h抗真菌感染，12天后復(fù)查胸部CT示：兩肺散在團片狀及結(jié)節(jié)狀高密度影較前片（2020-08-24）部分吸收。出院2個月后續(xù)隨訪患者胸悶氣急干咳癥狀較前好轉(zhuǎn)。

肺孢子菌肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia，PCP）與免疫功能低下的患者的發(fā)病率和死亡率顯著相關(guān)，包括中性粒細胞減少癥、異基因造血干細胞移植、實體器官移植、長期使用免疫抑制的患者，尤其是獲得性免疫缺陷綜合征患者[27]。PCP以發(fā)熱、干咳、呼吸困難為主要癥狀表現(xiàn)，影像學(xué)表現(xiàn)為磨玻璃片渾濁，呈中心狀分布，也可表現(xiàn)為結(jié)節(jié)，診斷依靠病原學(xué)。但由于標(biāo)本采集不理想、染色及對鏡檢的技術(shù)要求高，很難培養(yǎng)出病原體。本例入院后即予纖維支氣管鏡檢查，及時送檢標(biāo)本，行高通量測序，結(jié)果為G試驗陽性，余均陰性，考慮存在真菌感染，而NGS則準確定性病原體類型為卡式肺孢子菌，臨床根據(jù)NGS結(jié)果精準治療，療效確切。

3 亟待解決的問題

目前，高通量測序中測序平臺眾多，測序方法與技術(shù)不盡相同，故有不同的測序特點。當(dāng)前使用較多的是由Illumina提供的測序平臺，其缺點在于在同一過程中病原體會交叉污染其他樣本，從而導(dǎo)致假陽性；太平洋生物科學(xué)的測序平臺設(shè)備價格高昂，對樣本要求高；牛津納米孔技術(shù)雖提供了便攜式測序儀，測序時間較其他測序平臺短，但其測序錯誤高、通量低，“每次讀取成本高”的特點限制了它的使用。測序平臺的不同也導(dǎo)致了基因數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的不同，參考數(shù)據(jù)庫的不足可能導(dǎo)致假陰性。所以統(tǒng)一測序平臺和完善參考數(shù)據(jù)庫對于取得準確的結(jié)果至關(guān)重要。

在NGS的使用過程中，大多數(shù)樣本中的微生物核酸受人體宿主背景的支配，雖然測序的微生物非人類讀物相對較少，但依然影響測序結(jié)果的靈敏度。為了減少微生物的污染和結(jié)果的準確，NGS對樣本的提取要求較高。但是臨床樣本的采集不能做到完全無菌無核酸，所以需使用陰性對照，進行試劑評估，并定期測試，以避免實驗室和樣品的交叉污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。

4 總結(jié)

目前，高通量測序技術(shù)及基于高通量測序技術(shù)的臨床宏基因組學(xué)概念已經(jīng)應(yīng)用于臨床。從本文病例中可知，不明原因的發(fā)熱伴呼吸道感染者早期應(yīng)用NGS檢測病原體，及時診斷，臨床獲益較大。對于機會致病性病原體，定植菌、稀有病原體的檢測，臨床可供選擇的檢查較少，且敏感性低、陰性結(jié)果不能完全排除感染可能。NGS能夠快速、靈敏地檢測病原體，提供致病菌的種屬信息、病原體耐藥證據(jù)、毒力情況，幫助臨床醫(yī)生選擇合適的抗生素，陰性結(jié)果則能很大程度排除感染的可能。

近幾年，關(guān)于高通量測序的臨床報道層出不窮，但是幾乎所有的病例報告都是回顧性或小樣本研究，仍缺乏大規(guī)模的前瞻性研究來證實其臨床一線使用的可靠性和經(jīng)濟、社會效益。同時，也存在著平臺不一、樣本處理的試劑耗材各異、參考數(shù)據(jù)庫不同等問題。從長遠來看，建立統(tǒng)一的病原體分型標(biāo)準，構(gòu)建全球共享的高通量測序技術(shù)參考數(shù)據(jù)庫勢在必行。因此亟需大規(guī)模多中心臨床試驗制定統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準及檢測流程，從而實現(xiàn)感染性病原體的監(jiān)測與管理，以及高通量測序技術(shù)數(shù)據(jù)的精準靶向抗生素治療，推動個性化微生物學(xué)的發(fā)展[28]。