郭俊花，張?jiān)鰩?，馬 欣，成少寧

運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院，運(yùn)城 044000

果蔬采摘后易受到微生物侵染而腐敗，造成巨大的資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。目前主要使用化學(xué)防腐劑(如仲丁胺、撲海因、特克多、抗菌靈等)來控制果蔬腐敗，但化學(xué)防腐劑對人體具有一定危害性，且殘留期較長[1]。因此，綠色、安全、有效的天然果蔬防腐劑的開發(fā)已成為果蔬保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

我國藥用植物資源豐富。許多藥用植物中的功能成分，如黃酮、生物堿、揮發(fā)油、酚類、皂素類等具有較好的抑菌和殺菌作用[2]。研究證明，利用藥用植物提取液對果蔬具有良好的防腐保鮮作用。Li等[3]以芒果致腐菌為抑菌對象，研究了30種植物提取物的抑菌效果，結(jié)果表明丁香、金銀花等對褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌均有抑菌作用。Zhang等[4]研究了甘草、肉桂、高良姜等7種藥食兩種植物對李果實(shí)常見致腐真菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)甘草、肉桂提取液聯(lián)合使用對褐腐病菌抑菌效果最強(qiáng)。She等[5]對60種食藥兩用中藥進(jìn)行了抗菌防腐作用研究，結(jié)果表明丁香、花椒、高良姜表現(xiàn)出強(qiáng)的抗真菌作用，且高良姜具有較廣的抗菌菌譜。本研究以天麻、萊菔子、桔梗、葛根、覆盆子、金銀花、山茱萸、白芷、荷葉、高良姜、花椒共11種食藥同源植物為供試材料，從中篩選出對果蔬常見腐敗菌抑菌效果較好的植物，并以櫻桃番茄為例對抑菌效果進(jìn)行了實(shí)物驗(yàn)證。本研究提高了食藥同源植物的開發(fā)利用價值，并可為天然果蔬防腐劑的研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

天麻、萊菔子、桔梗、葛根、覆盆子、金銀花、山茱萸、白芷、荷葉、高良姜購于山西臨猗百草堂醫(yī)藥有限公司；花椒購于運(yùn)城美特好超市。櫻桃番茄購于水果市場，大小均一，無爛果。11種供試植物所屬科目及部位見表1。

表1 供試食藥同源植物

1.1.2 供試菌種

擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)、鏈格孢(Alternariaalternata)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)保存于運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 試劑

霉菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)，細(xì)菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氯化鈉購于廣東光華化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BS- 224型電子天平：德國賽多利斯有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液制備

將食藥同源植物用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后備用。稱取各植物粉末100 g，按料液比1∶6(m∶V)，用75%乙醇浸泡24 h后，放入超聲儀中，60 ℃超聲提取2 h，減壓抽濾。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用50%乙醇定容至100 mL，制成1 g/mL提取液，置于4 ℃冰箱中備用[6]。

1.3.2 提取液對霉菌抑菌效果檢測

用PDA培養(yǎng)基將各提取液稀釋至濃度為3.13 mg/mL的含藥平板，以加有50%乙醇的PDA培養(yǎng)基為對照，在各平板中央放置直徑為6 mm霉菌菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，采用十字交叉法對菌落直徑進(jìn)行測量，計(jì)算各物質(zhì)對三種霉菌的抑菌率[7]，公式如下：

式中：dC為對照菌落直徑(mm)；dT為處理菌落直徑(mm)；6是接種菌塊的直徑(mm)。

1.3.3 提取液對霉菌最小抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定

將不同濃度提取液添加到PDA培養(yǎng)基中，搖勻，制成提取液終濃度為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，以不含藥的PDA培養(yǎng)基為空白對照。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷凝后加入濃度為106～108的孢子菌懸液20 μL，涂布。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)[8]。將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.4 提取液對霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用試驗(yàn)

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[9]測定各提取液對三種霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用。采用二倍稀釋法制備5個提取液濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，最高濃度為試驗(yàn)得出的該提取液對試驗(yàn)菌的MIC，以不含藥的PDA培養(yǎng)基為空白對照。制備1×106CFU/mL的孢子菌懸液，并稀釋至約100 CFU/mL。吸取20 μL 菌懸液于含藥固體培養(yǎng)基平板中，涂布。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)完成后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，含藥平板菌落數(shù)記為C，對照組菌落數(shù)記為C0，計(jì)算抑制率。

1.3.5 提取液對細(xì)菌抑菌效果檢測

采用濾紙片擴(kuò)散法[10]測定各提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果。制備濃度為106～108的細(xì)菌菌懸液，取100 μL涂布LB培養(yǎng)基。將濾紙片(6 mm)于各提取液浸泡30 s后取出，置于培養(yǎng)基上，以浸泡50%乙醇的濾紙片作為對照。于37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，每組做3個平行。

1.3.6 提取液對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定

采用二倍稀釋法[11]，將不同濃度提取液添加到LB培養(yǎng)基中，搖勻，制成提取液終濃度為60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，以不含藥的LB培養(yǎng)基為空白對照。取濃度為106～107的菌懸液200 μL，涂布后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.7 提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌接種至LB液體培養(yǎng)基，添加不同量提取液到培養(yǎng)基中，使提取液濃度為MIC和1/2 MIC，以不加提取液的培養(yǎng)基為空白對照。置于37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h于600 nm測定培養(yǎng)基OD值，重復(fù)三次。以時間為橫坐標(biāo)，OD值平均值為縱坐標(biāo)繪制金黃色葡萄球菌生長曲線。

1.3.8 提取液對果實(shí)發(fā)病率影響

挑選顏色大小均一、無機(jī)械損傷和病蟲斑的櫻桃番茄進(jìn)行發(fā)病率測定[12]。櫻桃番茄經(jīng)0.1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min、自來水沖洗、蒸餾水沖洗后，陰干，備用。在櫻桃番茄赤道位置打2～3 mm深小孔，在提取液濃度為MIC的溶液中浸泡2 min后取出，以浸泡于無菌水的櫻桃番茄為空白對照。于小孔中注入20 μL霉菌孢子菌懸液(106～108CFU /mL)，晾干水分后用保鮮袋包裹，在20 ℃培養(yǎng)，分別于1、3、5、7天記錄發(fā)病個數(shù)，計(jì)算發(fā)病率。每30個作為一個處理，每個處理三個平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算及圖表制作。表2、表4和表5中的數(shù)據(jù)利用SPSS軟件中單因素ANOVA方法進(jìn)行方差分析，并用Duncan,s法比較數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。表7中的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液對霉菌抑菌效果

不同食藥同源植物提取液對三種霉菌的抑菌效果差別較大。由表2可知，花椒對三種霉菌抑菌效果突出，抑菌率均在90%以上。提取液對擴(kuò)展青霉抑菌效果較好，除天麻、桔梗、金銀花外，其他提取液抑菌效果均在50%以上，尤其是高良姜、萊菔子對青霉抑菌率較高。除花椒外，其他提取液灰葡萄孢抑菌作用較差。高良姜、萊菔子對鏈格孢也有一定抑菌作用。選擇抑菌效果較好的花椒、高良姜、萊菔子進(jìn)行最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定。

表2 提取液對三種霉菌的抑菌效果

注：同列不同字母表示差異顯著(P< 0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column indicate significant differences (P< 0.05),the same below.

2.2 提取液對霉菌最小抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定

由表3可知，花椒對擴(kuò)展青霉和灰葡萄孢的MIC均為25.00 mg/mL，MBC分別為50.00和100.00 mg/mL?；ń穼︽湼矜叩腗IC和MBC分別為50.00和100.00 mg/mL。高良姜對擴(kuò)展青霉和鏈格孢的MIC均為100.00 mg/mL。萊菔子對擴(kuò)展青霉的MIC和MBC分別為50.00和100.00 mg/mL，對鏈格孢的MIC為100.00 mg/mL。可以看出，花椒對三種菌的MIC和MBC最低，與抑菌效果測定一致。高良姜和萊菔子的MIC和MBC與表2抑菌效果略有不同，這可能與抑菌方式不同有關(guān)。

表3 提取液對三種霉菌的MIC和MBC

注：“-”表示無最低效力。

Note:“-” means no minimum effect.

2.3 提取液對霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

由以上試驗(yàn)可知，花椒對三種霉菌有較好的抑制作用，因此深入考察花椒對三種霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用。由表4可知，不同濃度的花椒對三種霉菌的孢子萌發(fā)均有一定抑制作用。提取物濃度為最小抑菌濃度時，對三種霉菌孢子萌發(fā)達(dá)到100%抑制。濃度降低，花椒對三種霉菌孢子的萌發(fā)抑制率也顯著降低。

2.4 提取液對2種細(xì)菌的抑菌效果

由表5可知，葛根和山茱萸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均無抑菌效果，其他提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果均優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌效果。高良姜、天麻對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均在30 mm以上，抑菌效果最佳；其次為萊菔子、金銀花、荷葉。萊菔子、金銀花、天麻、花椒、白芷對大腸桿菌有一定抑菌效果。

表4 花椒對三種霉菌的孢子萌發(fā)的抑制效果

表5 提取物對2種細(xì)菌的抑菌效果

注：“-”表示未出現(xiàn)抑菌圈。

Note:“-” means that no inhibition zone appeared.

2.5 提取物對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

由于提取液對金黃色葡萄球菌抑菌效果更佳，因此選擇金黃色葡萄球菌為供試菌。選擇對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的高良姜、天麻進(jìn)行MIC和MBC測定。由表6可知，高良姜的最小抑菌濃度和殺菌濃度分別為7.50和15.00 mg/mL，天麻的最小抑菌濃度和殺菌濃度分別為30.00和60.00 mg/mL。由此可知，高良姜和天麻對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不同，金黃色葡萄球菌對高良姜更敏感。

2.6 提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響

由圖1、圖2可知，未添加高良姜和天麻的對照組金黃色葡萄球菌生長狀況良好。添加高良姜和天麻后，生長曲線變化明顯，OD600值顯著降低，且添加量為MIC時OD600值小于添加量為1/2 MIC時OD600值。由此說明高良姜和天麻對金黃色葡萄球菌的生長均有較顯著的抑制作用，且其抑制作用與添加量呈正相關(guān)。

表6 提取物對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

2.7 提取液對果實(shí)發(fā)病率影響

為考查花椒對擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢在櫻桃番茄體內(nèi)的抑制效果，用MIC濃度的花椒提取液處理櫻桃番茄后，分別接種三種霉菌孢子，記錄果實(shí)發(fā)病率，結(jié)果見表7。三種霉菌對照組果實(shí)發(fā)病率迅速升高，第3天時果實(shí)發(fā)病率均超50%，第7天時達(dá)100%。用MIC濃度花椒提取液處理之后，果實(shí)發(fā)病率明顯降低，在第3天時發(fā)病率分別比對照組降低33.33%、40%、37.78%，在第7天時發(fā)病率分別比對照組降低43.33%、27.78%、31.11%，說明花椒提取液在櫻桃番茄體內(nèi)對擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢仍有較強(qiáng)的抑制作用，對櫻桃番茄有較好的防腐保鮮作用。

圖1 不同濃度高良姜提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Alpinia officinarum extracts on the growth of S.aureus

圖2 不同濃度高良姜提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Gastrodia elata extracts on the growth of S.aureus

表7 花椒對櫻桃番茄發(fā)病率的影響

注：*表示處理樣品與對照樣品在0.05水平有顯著性差異。

Note:*indicates that there is a significant difference between the treated sample and the control sample at the 0.05 level.

3 結(jié)論

擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為果蔬中常見腐敗菌，可侵染多種水果，造成大量經(jīng)濟(jì)損失。本研究以以上五種菌為供試菌，研究了11種食藥同源植物提取液的抑菌效果。

花椒對擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢抑菌效果突出，抑菌率均在90%以上?；ń诽崛∥餄舛葹樽钚∫志鷿舛葧r，對三種霉菌孢子萌發(fā)達(dá)到100%抑制。以櫻桃番茄為例進(jìn)行體內(nèi)抑菌驗(yàn)證試驗(yàn)表明，花椒提取液處理后的櫻桃番茄體與對照組相比果實(shí)發(fā)病率顯著降低，防腐效果明顯?；ń窞槭|香科花椒屬植物花椒樹的成熟果皮，有溫?zé)嶂雇?、殺菌止癢功效[13]。研究表明，花椒中含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類、香豆素等成分，這些成分對食品腐敗菌及致病菌有顯著抑菌作用，具有較寬抑菌譜[14,15]?；ń芬殉蔀橐环N具有開發(fā)前景的防腐保鮮劑。本試驗(yàn)中花椒對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果不顯著，可能與花椒提取方法有關(guān)，不能將有效抑菌成分充分提取。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，高良姜提取物對擴(kuò)展青霉和鏈格孢的抑菌率分別為94.56%和66.00%，萊菔子提取物對擴(kuò)展青霉和鏈格孢的抑菌率分別為78.20%和58.86%。高良姜、天麻提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈可達(dá)34.83和31.33 mm。高良姜屬姜科植物，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，高良姜具有抗氧化、抗病毒、降血糖、抗腫瘤、防癌、抗菌、防治心腦血管疾病等功效[16]。已有研究表明，高良姜提取物抑菌作用廣泛，其含有的二苯基庚烷、黃酮、揮發(fā)油等成分均有抑菌作用[17]。硫苷類化合物是萊菔子的特征性成分，主要指硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，硫苷降解產(chǎn)物提取液對大腸桿菌、歐氏桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌有抑菌效果。有研究表明，天麻中天麻多糖和天麻蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用[19,20]。但目前對天麻的研究主要為天麻活性成分提取和藥理功能研究，天麻的抑菌作用研究仍較少。

本試驗(yàn)結(jié)果說明，食藥同源植物在果蔬抑菌防腐方面具有廣泛的應(yīng)用前景，今后應(yīng)對提取方式、抑菌機(jī)理、聯(lián)合抑菌以及果蔬保鮮的實(shí)際應(yīng)用等方面進(jìn)行深入研究，以切實(shí)提高食藥同源植物的開發(fā)利用價值。