孫 穎 袁秋月 張維娜 高 媛 陳 龍

1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)，山東 泰安 271016； 2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最主要的惡性腫瘤之一，在全球女性癌癥發(fā)病率居第二位[1]，嚴重危害女性生命健康。由于宮頸癌預防篩查工作缺乏，確診時常伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等影響預后的中高危因素[2]，導致宮頸癌患者不良的生存結(jié)局。激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,屬于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，其表達上調(diào)受多種因素的影響，包括紫外線輻射、遺傳毒性因子和生長因子[3]。同時，ATF3可以作為調(diào)控各種信號傳導通路的靶基因，例如P53信號通路、c- Myc信號通路等[4- 5]。有研究報道，ATF3的高表達與肺癌的組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及總生存率降低存在顯著相關(guān)性，表明ATF3表達上調(diào)可促進肺癌的遷移和侵襲[6]。本研究回顧性分析2010年1月—2014年6月青島市市立醫(yī)院住院治療的180例宮頸癌患者組織中ATF3表達與臨床病理因素的相關(guān)性，并研究ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的影響，探討ATF3陽性表達與宮頸癌臨床病理因素及預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2014年6月在青島市市立醫(yī)院住院治療的病理診斷為宮頸癌且臨床病理資料完整的180例患者，資料主要包括：年齡、病理類型、臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、新輔助化療(化療方案為紫杉醇+鉑類)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁浸潤、脈管浸潤，并對180例入組宮頸癌患者進行5年隨訪，分析ATF3表達情況對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率影響。納入標準：①經(jīng)病理診斷確診為宮頸癌者；②所有病例按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO 2009)分期標準進行分期，具有完整臨床資料的I期～ⅡA期宮頸癌患者，所有宮頸癌患者治療均按照宮頸癌診治指南[7]；③無其他系統(tǒng)嚴重疾病者。排除標準：(1)合并其他部位原發(fā)腫瘤；(2)患有肝炎、肺炎、結(jié)腸炎等慢性炎癥；(3)患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾??；(4)臨床資料不全的患者。

1.2 研究方法

收集2010年1月—2014年6月在青島市市立醫(yī)院住院治療的宮頸癌患者臨床病理資料，將收集的宮頸癌患者存檔的手術(shù)切除標本包埋蠟塊切片，采用免疫組化法，檢測宮頸癌中ATF3蛋白表達情況。鼠抗人ATF- 3單克隆抗體購自美國Abcam公司,工作液有效配比濃度為1∶400；DAB顯色劑及二抗選自福州邁新生物公司。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以ATF- 3陽性的小鼠心肌細胞細胞核作為陽性對照。

1.3 結(jié)果評定

ATF3免疫組化染色陽性信號為黃色或棕黃色。觀察5個以上高倍視野(×400倍)計數(shù)≥1 000個細胞陽性細胞數(shù)，綜合染色強度和染色范圍進行判定。按著色強度計分：未著色或淡染者為1分，中強染色為2分，強染色為3分；染色范圍按陽性細胞數(shù)所占百分數(shù)計分：≤10%為1分，>10%～25%為2分，>25%～50%為3分，>50%～75%為4分，>75%為5分。兩項得分結(jié)果相加：≤3為陰性(-)，≥4為陽性(+)[8]。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS24.0軟件統(tǒng)計分析,計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(Fisher精確概率法)；采用Kaplan- Meier法繪制生存曲線并分析ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的影響；P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ATF3在宮頸癌組織中的表達及與其臨床病理因素的關(guān)系

ATF3蛋白在宮頸癌細胞胞漿及組織間質(zhì)中表達，且ATF3在宮頸癌周圍組織的脈管內(nèi)皮細胞表達顯著(如圖1，箭頭所示處)，在宮頸癌細胞核中未見ATF3蛋白的陽性表達。在180例宮頸癌患者中，60例患者ATF3表達陽性，120例患者ATF3表達陰性。同時，研究結(jié)果顯示，ATF3表達與臨床分期(P=0.011)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)、脈管浸潤(P=0.015)、新輔助化療(P=0.026)臨床病理因素分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與年齡(P=0.396)、病理類型(P=0.076)、組織學分級(P=0.102)、腫瘤直徑大小(P=0.182)、宮旁浸潤(P=0.075)無顯著關(guān)系。見表1。

圖1 宮頸癌患者ATF3在脈管的陽性表達(IHC×200)

表1 ATF3表達與宮頸癌臨床病理因素的關(guān)系

2.2 ATF3表達與宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率的關(guān)系

180例宮頸癌患者5年跟蹤隨訪結(jié)果顯示，相比ATF3陰性表達的患者，ATF3陽性表達患者的5年生存率及無進展生存率更低。ATF3陽性表達患者5年總生存率是80.7%，ATF3陰性表達患者5年總生存率是90.4%，ATF3表達陽性的患者5年總生存率較ATF3表達陰性的患者低9.7%，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.074)；ATF3陽性表達患者5年無進展生存率是78.7%，ATF3陰性表達患者5年無進展生存率是89.4%，ATF3表達陽性患者5年無進展生存率較ATF3表達陰性患者低10.7%，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058)，見圖2、圖3。

圖2 ATF3表達對總生存率影響

圖3 ATF3表達對無進展生存率影響

3 討 論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，最新報道顯示，我國宮頸癌發(fā)病率每年遞增4.1%，死亡率每年遞增5.9%[9]，嚴重威脅婦女健康。在我國，宮頸癌預防及篩查工作尚未普及，確診宮頸癌時常期別較晚且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等危險因素[2]，嚴重影響宮頸癌患者的生存預后。ATF3是ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一，可以直接或間接地改變多種基因表達，這些基因與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)，炎癥反應(yīng)是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制，并且ATF3表達還與細胞穩(wěn)態(tài)的維持、細胞損傷修復及粘附等有關(guān)[10- 11]。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌患者中，ATF3主要在宮頸癌細胞胞漿及正常的組織間質(zhì)中表達，這與本研究小鼠心肌細胞陽性對照組不一致，在宮頸癌患者的組織中，ATF3蛋白存在異位表達，即ATF3異位表達于宮頸癌細胞胞漿及組織間質(zhì)中，進而有利于腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。并且，研究發(fā)現(xiàn)，ATF3在宮頸組織中脈管內(nèi)皮細胞上表達顯著(如圖1)，ATF3在脈管內(nèi)皮細胞上的異位表達可能與宮頸癌的脈管浸潤有關(guān)。

有研究顯示，在肺癌、乳腺癌中，ATF3表達與組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，從而表明ATF3表達與乳腺癌、肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6,12]。本研究結(jié)果顯示，ATF3表達陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、臨床分期有關(guān)(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌主要的轉(zhuǎn)移途徑，ATF3可能通過某些機制促使癌細胞進入癌組織周圍淋巴管內(nèi)，在淋巴管內(nèi)形成瘤栓，隨淋巴液到達局部淋巴結(jié)，從而導致宮頸癌細胞的脈管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；宮頸癌臨床分期越晚，侵及范圍越大，腫瘤負荷增加，ATF3異位表達量相應(yīng)增多。因此，我們推測ATF3表達可能與宮頸癌的轉(zhuǎn)移、浸潤有關(guān)，可能是評價宮頸癌轉(zhuǎn)移浸潤程度的重要指標。

因此，ATF3作為一種適應(yīng)反應(yīng)基因,在宮頸癌、乳腺癌及肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。除此之外，最近研究表明，ATF3也可根據(jù)腫瘤類型及環(huán)境的不同發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用，例如，ATF3可能作為抑癌基因，在抑制食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌及前列腺癌的形成、浸潤及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮一定的作用[13- 18]。例如，有研究表明，ATF3表達與人結(jié)腸癌細胞中的細胞凋亡有關(guān)，柚皮素(naringenin，NAR)作為一種葡萄柚中黃酮類化合物，具有抗癌活性，柚皮素能刺激人結(jié)腸癌細胞ATF3表達上調(diào)，從而誘導人結(jié)腸癌細胞凋亡，抑制結(jié)腸癌的形成及發(fā)展[18]。然而，在其他腫瘤類型中，ATF3促進或抑制腫瘤發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移的具體分子生物學機制尚不明確。

紫杉醇是一種廣譜、高效的抗腫瘤的化學治療藥物，具有穩(wěn)定細胞骨架、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡的作用，在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用[19]。然而，Tsonwin等人[10]研究結(jié)果顯示，紫杉醇通過ATF3介導能促進血管生長，改變癌細胞轉(zhuǎn)移微環(huán)境，可能與小鼠的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，此研究結(jié)果與紫杉醇的抗腫瘤作用的觀念相悖。血管內(nèi)皮生長因子可調(diào)節(jié)血管生成、增加血管通透性，促進內(nèi)皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，并且，血管內(nèi)皮生長因子可以與相對應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)高親和力特異性的結(jié)合，在癌癥轉(zhuǎn)移、浸潤方面發(fā)揮重要作用。例如，VEGF與其相應(yīng)的VEGFR- 3結(jié)合，可調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管形成[20]；VEGF通過與VEGFR- 2結(jié)合，可調(diào)節(jié)腫瘤新生血管形成[21]。紫杉醇可能通過某些機制介導ATF3表達上調(diào)，并使血管內(nèi)皮生長因子合成、分泌增加，其與相應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子受體高親和力結(jié)合，從而促進小鼠乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)如今，為了提升宮頸癌手術(shù)切除癌灶滿意度及增加局部晚期患者手術(shù)機會，以紫杉醇聯(lián)合鉑類新輔助化療方案開始廣泛應(yīng)用于宮頸癌治療。Symonds等人[22]研究表明，在復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性宮頸癌中，以紫杉醇為基礎(chǔ)聯(lián)合化療中加入血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制劑可延長患者總生存期及無進展生存期。本研究結(jié)果表明，ATF3陽性表達與新輔助化療有關(guān)(P<0.05)。因此，本研究結(jié)果提示新輔助化療方案中的紫杉醇可能通過某些機制上調(diào)ATF3表達，從而進一步介導血管內(nèi)皮生長因子合成、分泌增加，其分別與相應(yīng)VEGFR結(jié)合，促使宮頸癌組織中新生脈管形成，從而促進宮頸癌的轉(zhuǎn)移、浸潤。

對入組的宮頸癌患者進行隨訪，研究結(jié)果顯示，相比ATF3陰性表達的宮頸癌患者，ATF3陽性表達的患者5年生存率及無進展生存率更低(ATF3表達陽性的宮頸癌患者5年總生存率較ATF3表達陰性患者低9.7%，ATF3表達陽性的宮頸癌患者5年無進展生存率較ATF3表達陰性低10.7%)。在肺癌中，Li等人[6]研究結(jié)果證明，ATF3高表達與肺癌的總生存率降低有關(guān)。ATF3異位表達可能與宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，從而降低了宮頸癌患者的5年總生存率和無進展生存率。本研究表明，ATF3陽性表達與新輔助化療有關(guān)，新輔助化療方案中的紫杉醇可能介導ATF3陽性表達上調(diào)，從而促進宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移，降低宮頸癌患者的5年總生存率及無進展生存率；ATF3陽性表達患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤的患者偏多，且期別較晚，降低了ATF3陽性組宮頸癌患者的5年總生存率及無進展生存率。因此，我們考慮ATF3陽性表達可能與宮頸癌患者不良預后有關(guān)，可在一定程度上預測宮頸癌患者的預后。由于本研究所納入的宮頸癌患者例數(shù)有限，ATF3表達對宮頸癌患者5年總生存率及無進展生存率是否有影響(P<0.05)，仍需要擴大樣本量進一步研究。

總之，我們的研究表明，ATF3陽性表達在宮頸癌細胞胞漿及組織間質(zhì)中，可能與ATF3的異位表達有關(guān)。同時，ATF3表達與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、新輔助化療有關(guān)，提示ATF3表達可能促進宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移，且新輔助化療方案中的紫杉醇可能促進ATF3表達上調(diào)，從而進一步促進宮頸癌的脈管浸潤轉(zhuǎn)移。并且，研究發(fā)現(xiàn)，與ATF3陰性表達的宮頸癌患者相比，ATF3陽性表達的患者5年生存率及無進展生存率更低，雖然差異并無統(tǒng)計學意義，但在一定程度上提示ATF3表達與宮頸癌的預后有關(guān)，可能作為評估宮頸癌患者預后的指標，后續(xù)仍需進一步擴大樣本驗證。

由此，我們認為，ATF3表達可能是推測宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移程度以及評價宮頸癌預后的重要指標。然而，在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中，紫杉醇通過哪些機制上調(diào)ATF3表達，VEGF是否參與該過程或在其中的作用機制等問題目前尚未明確，需要大樣本量前瞻性隨機對照研究予以證實。