李園園，劉愛(ài)華

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是缺血心肌在恢復(fù)血液灌注后，引起超微結(jié)構(gòu)、心功能、能量代謝和電生理方面發(fā)生進(jìn)一步的損傷。發(fā)生MIRI時(shí)肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum， SR)中Ca2+循環(huán)(包括SR Ca2+釋放和攝取)異常導(dǎo)致心肌功能受損。心肌SR的Ca2+攝取主要由2型肌漿網(wǎng)鈣泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)完成。受磷蛋白(phospholamban， PLN /PLB)被認(rèn)為是直接參與心臟疾病發(fā)展的SERCA2a相關(guān)蛋白[1]。PLN的磷酸化修飾改變肌漿網(wǎng)鈣泵的結(jié)構(gòu)和功能，控制SR鈣攝取進(jìn)而改變心肌功能，參與心臟生理功能及疾病的調(diào)控。本研究對(duì)PLN磷酸化調(diào)控在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的作用做一綜述。

1 SERCA/PLN轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能

心肌胞質(zhì)鈣穩(wěn)態(tài)主要是幾種關(guān)鍵的心肌SR鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)的結(jié)果。心肌興奮時(shí)膜去極化，L型Ca2+通道開(kāi)放引起Ca2+內(nèi)流，激活SR上的2型蘭尼堿受體(ryanodine receptor， RyR2)，進(jìn)一步誘導(dǎo)SR釋放更多Ca2+[2]。胞質(zhì)Ca2+濃度的升高，引起心肌收縮。同時(shí)SR上的SERCA2a激活，升高的Ca2+被主動(dòng)攝回SR及被胞膜上的鈉鈣交換體(Na+/Ca2+-exchanger， NCX1)泵出胞外，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+回落，引起肌肉松弛。

鑒于哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞舒張期70%，甚至80%以上(小嚙齒動(dòng)物93%)的Ca2+通過(guò)SERCA2a攝回至SR，SERCA2a是使心肌舒張期胞內(nèi)鈣濃度下降的主要因素。盡管SERCA2a與一系列的蛋白相互作用(包括HRC、PP1、calreticulin、S100A和sarcolipin)，PLN對(duì)調(diào)節(jié)SERCA2a活性至關(guān)重要。因此，兩者構(gòu)成的SERCA/PLN轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能備受關(guān)注，并被廣泛研究。

1.1 SERCA2a的結(jié)構(gòu)和功能 SERCA2a為主要的心臟異構(gòu)體。SERCA2a是分子質(zhì)量約為110 kDa的跨膜蛋白，占心肌內(nèi)SR總蛋白含量的40%。SERCA2a的功能是調(diào)控SR的Ca2+回?cái)z。在心臟中，SERCA2a的活性控制胞質(zhì)Ca2+去除速率和SR Ca2+負(fù)載程度，是心臟舒張和收縮的基本決定因素。在心臟中過(guò)表達(dá)SERCA2a蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的SR Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和心肌收縮力[3]。然而心臟特異性敲除SERCA2的小鼠即使在心肌細(xì)胞沒(méi)有可檢測(cè)到的SERCA2蛋白水平也能存活7周，但8周后心臟舒張和收縮功能?chē)?yán)重下降引起高死亡率，由此推測(cè)似乎只有在NCX代償機(jī)制失敗時(shí)SERC2a含量的降低才對(duì)心功能產(chǎn)生不利影響[4]。

1.2 PLN的結(jié)構(gòu)和功能 PLN是由52個(gè)氨基酸組成的小整合膜蛋白，具有3個(gè)獨(dú)特的可磷酸化位點(diǎn)(Ser10、Ser16和Thr17)[5]，主要以單體(6 kDa)和五聚體(30 kDa)存在。PLN的單體形式是抑制SERCA2a的主要種類(lèi)。最近有證據(jù)表明PLN的五聚體也能夠結(jié)合SERCA2a[6]，但其功能尚未被闡述。在功能上，PLN是SR上SERCA2a的主要調(diào)節(jié)因子[7]，通過(guò)直接抑制SERCA2a對(duì)SR Ca2+的攝取來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的去除。因此，PLN/SERCA2a比率是基礎(chǔ)收縮力的關(guān)鍵決定因素。

2 MIRI中PLN的磷酸化調(diào)控

SR在再灌注伊始就控制胞質(zhì)鈣超載的命運(yùn)，被認(rèn)為是防治MIRI的主要靶標(biāo)[8]。SERCA2a過(guò)表達(dá)可以通過(guò)減輕鈣超載來(lái)對(duì)抗缺血再灌注心律失常作用，改善收縮功能[9]。

2.1 PLN的磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié) 目前已經(jīng)明確PLN的活性受到兩個(gè)殘基磷酸化的嚴(yán)格調(diào)控：由PKA介導(dǎo)的Ser16位點(diǎn)和由CaMKⅡ介導(dǎo)的Thr17位點(diǎn)磷酸化。

2.1.1 PLN雙位點(diǎn)的磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié) 1998年Luo等[10]用轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)雙位點(diǎn)磷酸化進(jìn)行研究，認(rèn)為Ser16的磷酸化是Thr17磷酸化的前提條件，從此拉開(kāi)了用9～19位殘基上的PLN多肽研究PLN雙位點(diǎn)磷酸化的序幕。首先在1999年，Currie等[11]在心功能衰竭兔左心室中觀察到PLN Ser16和Thr17磷酸化水平都升高，但磷酸化增加的機(jī)制并不清楚。2002年，Vittone等[12]對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)離體大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)中PLN的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Ser16磷酸化在缺血20 min后顯著增加，可以被PKA抑制劑H-89取消，但在再灌注后立即恢復(fù)正常；而Thr17磷酸化在缺血2～5 min和再灌注1 min時(shí)瞬時(shí)增加，可被CaMKⅡ抑制劑KN93減輕。Said等[13]在2003年用Ala替代Ser16或Thr17后發(fā)現(xiàn)，PLN-S16A小鼠僅在再灌初期受損，PLN-T17A小鼠的心功能恢復(fù)在整個(gè)再灌注時(shí)期都嚴(yán)重受損，說(shuō)明盡管兩種位點(diǎn)磷酸化都參與缺血后的機(jī)械恢復(fù)，但Thr17位點(diǎn)似乎起主要作用。上述研究表明PLN雙位點(diǎn)的磷酸化增加對(duì)IRI都具有心臟保護(hù)作用。

2.1.2 PLN單一位點(diǎn)的磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié) 隨著Thr17磷酸化被發(fā)現(xiàn)在增加心臟刺激頻率、胞內(nèi)鈣濃度升高、IRI及酸中毒時(shí)并不依賴(lài)于Ser16[14-15]，隨后PLN單一位點(diǎn)的磷酸化研究出現(xiàn)了大相徑庭的結(jié)果。

2.1.2.1 PLN的Ser16位點(diǎn)磷酸化 首先是Xie等[16]發(fā)現(xiàn)缺血30 min和再灌注1 min時(shí)Ser16磷酸化增加，但在再灌注30 min時(shí)降低。隨后發(fā)現(xiàn)豬未成熟心臟IRI后[17]PLN的Ser16位點(diǎn)磷酸化降低。最近的研究表明心肌梗死病人左心室肌PLN Ser16磷酸化降低[18]。因此，在IRI及梗死心肌，心臟功能的降低都與PLN的Ser16位點(diǎn)磷酸化降低相關(guān)。

2.1.2.2 PLN的Thr17位點(diǎn)磷酸化 與Ser16位點(diǎn)一致，短暫缺血再灌引起Thr17位點(diǎn)PLN的磷酸化水平下降。大鼠離體心臟缺血30 min時(shí)，再灌注30 min時(shí)與異丙腎上腺素誘導(dǎo)的磷酸化[16]和缺血前心肌[19]相比，Thr17位點(diǎn)的磷酸化水平降低，還伴有CaMKⅡ的活性降低[19]。之后在CaMKⅡδ異構(gòu)體特異性敲除的小鼠心肌發(fā)現(xiàn)Thr17磷酸化降低，使心肌細(xì)胞舒張期SERCA2a回?cái)zCa2+的速率減慢，舒張功能受損[20]，但并未改變SR的Ca2+含量。在體證據(jù)也顯示：小鼠缺血30 min再灌注30 min后CaMKⅡ介導(dǎo)的Thr17位點(diǎn)的PLN磷酸化水平降低是SERCA2a活性下調(diào)的直接原因[21]。上述實(shí)驗(yàn)研究提示：可通過(guò)CaMKⅡ的活化來(lái)增加Thr17位點(diǎn)的PLN磷酸化而增強(qiáng)SERCA2a活性，防止Ca2+超載和限制細(xì)胞死亡，幫助缺血后的機(jī)械恢復(fù)而減少再灌注損傷。

與上述研究相悖，Inserte等[22]發(fā)現(xiàn)繼續(xù)延長(zhǎng)缺血時(shí)間到40 min，再灌注3 min時(shí)顯示大鼠心肌Ser16和Thr17的磷酸化達(dá)到頂峰，隨后會(huì)衰退，在再灌注10 min時(shí)檢測(cè)不到。而對(duì)再灌注開(kāi)始時(shí)瞬時(shí)抑制PKA和CaMKⅡ從而抑制PLN的磷酸化，獲得了類(lèi)似心臟保護(hù)作用，故認(rèn)為減少再灌注開(kāi)始時(shí)的PLN磷酸化能夠減輕IRI。分析其原因可能為CaMKⅡ的作用靶點(diǎn)除了PLN，還有肌漿網(wǎng)鈣釋放通道RyR2的磷酸化也發(fā)生改變。由于CaMKⅡ同時(shí)介導(dǎo)的Thr17位點(diǎn)PLN磷酸化和S2814位點(diǎn)上RyR2的磷酸化，對(duì)心臟起到了雙刃劍的作用：雖然PLN磷酸化恢復(fù)SERCA2的攝鈣功能有保護(hù)作用，但是此時(shí)S2814位點(diǎn)上RyR2的磷酸化導(dǎo)致RyR功能增強(qiáng)，加劇SR鈣泄漏[23-24]。當(dāng)CaMKⅡ?qū)R鈣泄漏的促進(jìn)作用超過(guò)其促進(jìn)SERCA再攝取鈣的保護(hù)效應(yīng)時(shí)，即促進(jìn)心功能障礙的發(fā)展。

PLN磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié)及缺血心臟功能的影響可能隨著疾病的進(jìn)程不同而變化，受到模型缺血時(shí)間、動(dòng)物種屬、樣本來(lái)源、抗體種類(lèi)和比較的標(biāo)準(zhǔn)影響，尤其是CaMKⅡ的雙刃劍作用使得人們?cè)趯LN磷酸化作為防治缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)時(shí)，需要兼顧SR鈣攝取功能的恢復(fù)和SR鈣泄漏的傾向，維持SR鈣攝取和鈣泄漏之間的平衡。

2.2 PLN去磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié) 除了蛋白激酶可催化PLN磷酸化，蛋白磷酸酶可催化PLN發(fā)生去磷酸化。目前PLN去磷酸化對(duì)SERCA2a的調(diào)節(jié)研究主要集中在絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。

早期的研究表明蛋白磷酸酶1(PP1)是主要的去磷酸化PLN的磷酸酶，其活性在心力衰竭病人心臟顯著升高。在心臟SR，PP1被內(nèi)源性抑制劑inhibitor(I-1和I-2)所調(diào)節(jié)，因此，其抑制劑I-1和I-2常被用來(lái)進(jìn)行關(guān)于PP1作用的研究。隨后發(fā)現(xiàn)在人衰竭的心臟由于I-1蛋白水平和磷酸化的減少，導(dǎo)致磷酸酶活性增加，Ser16位點(diǎn)上的PLN磷酸化降低[25]。因此，PP1被認(rèn)為是心臟功能主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。

蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2(PP2)被發(fā)現(xiàn)在IRI異常的SR鈣循環(huán)中發(fā)揮作用。早年人們觀察到缺血30 min再灌注30 min致IRI大鼠心臟中SR蛋白磷酸酶活性[19， 26]，PP1和PP2A的活性都比缺血前有所降低[19]。然而近年來(lái)對(duì)IRI大鼠蛋白磷酸酶的研究卻顯示相反的變化。首先是在大鼠心臟左前降支結(jié)扎20～30 min造模后，與非危險(xiǎn)區(qū)相比，危險(xiǎn)區(qū)心肌PLN在Ser16位點(diǎn)和Thr17位點(diǎn)磷酸化減少，SR攝鈣功能受損而誘發(fā)再灌注時(shí)鈣超載，其機(jī)制為缺血增強(qiáng)PP2B活性，激活PKC-α，使I-1 失活而間接激活PP1[27]。隨后有報(bào)道延長(zhǎng)再灌時(shí)間到120 min的IRI大鼠心肌中PP1α的蛋白表達(dá)比對(duì)照組顯著上升，損害了心肌收縮和舒張功能[28]。另外，在IRI后24 h遠(yuǎn)端未缺血心肌中PLN的Ser16磷酸化水平降低，這種降低與PKA無(wú)關(guān)，而是PP2A活性升高去磷酸化增加引起的[7]。造模方式、缺血或再灌時(shí)間和比較標(biāo)準(zhǔn)的差異，加上蛋白磷酸酶的亞型繁多，造成了PLN去磷酸化在IRI心肌表現(xiàn)迥異。上述差異也提示在IRI早期機(jī)體可能存在代償機(jī)制，磷酸酶活性降低使PLN去磷酸化減少，促進(jìn)SR鈣攝取保護(hù)心臟功能，而隨著病情加重進(jìn)程延長(zhǎng)，機(jī)體失代償激活磷酸酶促進(jìn)PLN去磷酸化，導(dǎo)致再灌注時(shí)鈣超載引起心肌損傷。值得注意的是，能催化Thr17位上PLN磷酸化的CaMKII自身磷酸化受到PP1、 PP2等調(diào)節(jié)，能催化Ser16位上PLN磷酸化的PKA，又能激活PP1的內(nèi)源性抑制物I-1，使得PLN磷酸化調(diào)控變得更加錯(cuò)綜復(fù)雜。

3 結(jié) 語(yǔ)

蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同構(gòu)成了PLN磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。激酶和磷酸酶分別與PLN相互作用，調(diào)節(jié)SERCA2a的功能從而影響鈣穩(wěn)態(tài)，精細(xì)調(diào)控SR的鈣攝取和貯存。目前對(duì)激酶在MIRI鈣循環(huán)異常中的作用進(jìn)行了詳盡的探討，但對(duì)磷酸酶的研究方興未艾。接下來(lái)需要大量的工作對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)IRI的磷酸化以及磷酸酶進(jìn)行研究，以期維持這一開(kāi)關(guān)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，為MIRI發(fā)病機(jī)制及精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)和新的思路。