鄒添添，覃偉，朱迎，李天恩，欽倫秀，董瓊珠

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 普通外科，上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所，上海 200040）

眾所周知，腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展所處的內(nèi)外環(huán)境，在腫瘤進(jìn)程、免疫逃逸和治療抵抗中發(fā)揮重要作用[1]。腫瘤微環(huán)境主要由腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、髓系來(lái)源細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞組分，以及分泌的炎癥因子和趨化因子等非細(xì)胞成分組成[2]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱肝癌）是典型的炎性相關(guān)性惡性腫瘤，其微環(huán)境中包含大量的巨噬細(xì)胞及一系列固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，形成復(fù)雜的免疫耐受微環(huán)境[1,3]。免疫治療可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，激發(fā)腫瘤特異性免疫，打破免疫耐受，重新激活免疫細(xì)胞等途徑使其識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到延緩腫瘤進(jìn)展的目的。目前已有多種免疫療法應(yīng)用于晚期肝癌治療[4]。本文重點(diǎn)總結(jié)肝癌微環(huán)境的主要組分及其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用、以及相關(guān)免疫治療的最新進(jìn)展。

1 肝癌的微環(huán)境

肝臟具有一定的特殊性，由于其經(jīng)常暴露于腸源性抗原進(jìn)而形成了免疫耐受的微環(huán)境，故被稱為免疫特赦器官[5]。在我國(guó)，肝癌多發(fā)生在慢性乙型肝炎（以下簡(jiǎn)稱“乙肝”）等基礎(chǔ)上，在患者數(shù)十年的肝炎病程中，各種炎性細(xì)胞相互作用，形成了更為復(fù)雜的微環(huán)境，導(dǎo)致肝癌微環(huán)境常伴隨慢性炎癥[6]。肝癌的微環(huán)境主要由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TAN）、骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）等細(xì)胞組分，以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、細(xì)胞因子等非細(xì)胞組分組成。與其他腫瘤相比，肝癌免疫微環(huán)境表現(xiàn)為更強(qiáng)的免疫抑制作用，幾乎所有細(xì)胞亞群和眾多調(diào)控機(jī)制都有助于肝癌的進(jìn)展。例如庫(kù)普夫細(xì)胞是肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞，其通過產(chǎn)生抗炎分子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、IL-10和前列腺素E2（PGE2），在抑制性微環(huán)境的形成的過程中發(fā)揮重要作用[7]。在病毒性肝炎介導(dǎo)肝癌的發(fā)生過程中，病毒感染可以通過驅(qū)動(dòng)肝臟慢性炎癥、分泌多種抑制性性因子促進(jìn)肝癌發(fā)展和免疫逃逸[8]。此外，乙肝患者肝內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的浸潤(rùn)頻率與病毒載量相關(guān)，表明慢性病毒性肝炎感染肝臟中Treg的積累可能會(huì)阻止CD8+T細(xì)胞對(duì)病毒清除[9]。肝癌顯著的免疫抑制微環(huán)境對(duì)有效的肝癌免疫治療將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

1.1 TAM

TAM是肝癌微環(huán)境的重要組成部分，根據(jù)其功能特點(diǎn)，可分為兩種類型：經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（classically activated macrophage，M1）和替代活化型巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophage，M2）[10]。既往認(rèn)為巨噬細(xì)胞可以直接殺傷腫瘤、或者遞呈抗原給T細(xì)胞，具有消滅腫瘤的能力，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，TAM促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。近期，研究者們通過單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示肝癌免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)：TAM-like和MDSC-like狀態(tài)[12]。一般認(rèn)為，TAM來(lái)源于外周血單核細(xì)胞，可被腫瘤微環(huán)境分泌的細(xì)胞因子如CCL2、CSF1等招募至腫瘤周圍，腫瘤微環(huán)境將單核細(xì)胞“馴化”為M2型巨噬細(xì)胞，分泌抑炎性細(xì)胞因子如IL-8、IL-10、TGF-β等，促進(jìn)血管生成、抗炎及基質(zhì)重塑，誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡，抑制Th1型免疫反應(yīng)，重塑微環(huán)境，影響免疫穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[13-15]。目前，越來(lái)越多的研究[13,16-18]證實(shí)，TAM影響包括肝癌在內(nèi)多種腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后。我們課題組發(fā)現(xiàn)TAM與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控基因骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)密切相關(guān)，聯(lián)合OPN及TAM可以預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后，即使在甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）陰性的肝癌患者中，兩者聯(lián)合也具有很好的預(yù)測(cè)效能[15]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OPN可通過PI3K-Akt-p65通路刺激巨噬細(xì)胞分泌CSF1，激活CSF1/CSF1R通路，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，上調(diào)肝癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，營(yíng)造抑制性免疫微環(huán)境并誘導(dǎo)肝癌的免疫逃逸[19]。因此，針對(duì)TAM設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[20-22]。

1.2 TAN

TAN作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中扮演著多重角色。早在2009年，F(xiàn)ridlender等[23]將TAN劃分為抑制腫瘤的N1和促腫瘤的N2亞型。N1表型具有細(xì)胞毒性和促炎活性，而N2表型具有較強(qiáng)的免疫抑制能力[24]。大量研究發(fā)現(xiàn)TAN能夠分泌細(xì)胞因子、基質(zhì)蛋白酶等促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；另一方面，中性粒細(xì)胞自身的細(xì)胞毒性對(duì)腫瘤也具有一定殺傷作用[25]。隨著研究的深入，TAN在塑造轉(zhuǎn)移前龕、捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）及免疫抑制方面的獨(dú)特作用越來(lái)越受到關(guān)注，其在肝癌的進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。既往研究[26-27]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）可反映肝癌轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。TAN通過招募TAM和Treg，促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和血管形成[28]。此外，TAN可通過激活miR-301b-3p/LSAMP/CYLD通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的“干性”；同時(shí)，這些干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞分泌趨化因子CXCL5，招募TAN瘤內(nèi)浸潤(rùn)，從而構(gòu)成TAN-干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞環(huán)路，促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[29]。近年研究[30-31]證實(shí)TAN通過向胞外釋放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET），通過炎癥與免疫調(diào)控影響腫瘤進(jìn)展。我們課題組發(fā)現(xiàn)肝癌患者中NET形成能力顯著增強(qiáng)，并與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NET通過捕獲CTC、并增加其遷移能力及血管新生最終促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[32]。

1.3 MDSC

MDSC是具有顯著異質(zhì)性的抑制性免疫細(xì)胞，分布于骨髓、脾臟、外周血和腫瘤組織中，可分為單核MDSC（M-MDSC）和粒細(xì)胞或多形核MDSC（PMN-MDSC）兩種類型[33]。近年來(lái)MDSC被認(rèn)為是免疫抑制細(xì)胞的核心，具有多種促腫瘤作用。其可通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)破壞先天性和獲得性抗腫瘤免疫[34]。另外，有大量文獻(xiàn)報(bào)道MDSC可通過誘導(dǎo)Treg分化增殖、抑制DC、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞極化狀態(tài)和巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮免疫抑制作用[35-37]。在肝癌中，已發(fā)現(xiàn)肝癌患者外周血MDSC可以預(yù)測(cè)患者預(yù)后。與肝炎或肝硬化患者及健康對(duì)照組相比，肝癌患者外周血MDSC的數(shù)量顯著增加，而且外周血高密度的MDSC與腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[38-40]。肝癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如G-CSF、GM-CSF、VEGF、CCRK、IL-1β等可誘導(dǎo)MDSC浸潤(rùn)，靶向MDSC能增強(qiáng)索拉非尼或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤作用[41-42]。

1.4 CAF

CAF是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，幾乎存在于所有實(shí)體瘤中。肝癌組織中CAF特定的分子標(biāo)志物如成纖維細(xì)胞激活蛋白（fibroblast activating protein，F(xiàn)AP）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等高表達(dá)的患者，往往預(yù)后較差，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[43]。越來(lái)越多的研究[44-45]證實(shí)CAF可通過分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)，CAF通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞叉頭框蛋白Q1（FOXQ1）的表達(dá)并激活調(diào)節(jié)基因1（NDRG1）促進(jìn)肝癌干性特征。激活的肝癌細(xì)胞分泌C-C基趨化因子配體26（chemokine ligand 26，CCL26）從而招募更多的CAF促進(jìn)肝癌進(jìn)程[46]。在血管生成中，CAF通過CXCL12招募內(nèi)皮祖細(xì)胞，并通過產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶參與組織重塑，促進(jìn)血管形成。而且，CAF可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移的能力[47]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，CAF可通過分泌趨化因子等調(diào)節(jié)周圍免疫細(xì)胞，在腫瘤免疫調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。CAF可誘導(dǎo)TAN等髓系來(lái)源的免疫抑制性細(xì)胞介導(dǎo)免疫抑制的發(fā)生，參與肝癌免疫逃逸[48-50]。因此，靶向CAF的特異性分子標(biāo)志物如FAP及靶向CAF特異基因抑制劑的治療方案可能會(huì)成為一種有效的肝癌輔助治療。

1.5 TIL

TIL是肝癌微環(huán)境的重要組成部分。早期臨床數(shù)據(jù)表明，肝癌術(shù)后高水平淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是T細(xì)胞，可以減少?gòu)?fù)發(fā)，提高生存率[51]。TIL主要包括Treg、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和B 細(xì)胞等。Treg 是一種CD4+T 細(xì)胞的亞群，可通過多種方式抑制腫瘤免疫[52]。已發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Treg細(xì)胞大量增加，且與門靜脈癌栓形成、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[53]。Treg-細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）比值（Treg/CTL）反應(yīng)肝癌局部免疫平衡狀態(tài)，當(dāng)CTL增多時(shí)，可以有效地對(duì)抗Treg對(duì)患者免疫系統(tǒng)的抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，有利于殺傷腫瘤細(xì)胞[54]。研究[53]發(fā)現(xiàn)肝癌中高密度的腫瘤浸潤(rùn)性CD4+CD25+Foxp3+Treg，預(yù)示不良預(yù)后。Lee 等[55]發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+Treg的增加與腫瘤大小相關(guān)，且這些CD4+CD25+Treg抑制肝癌中DC的免疫應(yīng)答。這些證據(jù)表明，抑制Treg可能是誘導(dǎo)肝癌免疫應(yīng)答的重要途徑。NK細(xì)胞和CTL是在腫瘤免疫監(jiān)視和腫瘤細(xì)胞根除中起著不可或缺的作用的抗腫瘤免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)且能在不需要在致敏的情況下直接介導(dǎo)細(xì)胞毒副作用[56]。但在腫瘤內(nèi)部NK細(xì)胞功能通常受到抑制。近期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌高表達(dá)的miR-561-5p直接靶向降低CX3CL1的表達(dá)，減少微環(huán)境中CX3CR1+NK細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活并促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移[57]。肝癌細(xì)胞外泌體來(lái)源的circUHRF可通過miR-449c-5p/TIM-3途徑抑制NK細(xì)胞功能、促進(jìn)肝癌的免疫逃逸和抗PD-1免疫療法的耐藥性[58]。CD8+T淋巴細(xì)胞是肝癌的主要CTL，研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞Fas/Fas L 的表達(dá)與肝癌抗腫瘤免疫呈正相關(guān)[59]。然而，CTL介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的有效性受到多種機(jī)制的限制，例如T細(xì)胞或肝癌細(xì)胞中大量免疫調(diào)節(jié)分子的高表達(dá)（如IL-10、Fas/FasL、CXCL17、VEGF、吲哚胺-2,3二氧合酶等），微環(huán)境改變（如乳酸過載、低p H、缺氧），與腫瘤細(xì)胞的“代謝競(jìng)爭(zhēng)”以及缺乏CD4+T細(xì)胞的輔助等都可能是CTL功能受限的原因[59-61]。B細(xì)胞也是人體腫瘤組織中的一個(gè)重要免疫成分。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明B細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤預(yù)后和免疫治療療效密切相關(guān)[62-63]。在晚期肝癌組織中，PD-1高表達(dá)的B細(xì)胞浸潤(rùn)水平與肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)呈顯著正相關(guān)，模式識(shí)別受體TLR4引起的Bcl-6上調(diào)是肝癌組織微環(huán)境引起PD-1高表達(dá)B細(xì)胞產(chǎn)生的重要機(jī)制且激活PD-1信號(hào)通路能夠刺激該群細(xì)胞分泌IL-10從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)[64]。此外，肝癌中B細(xì)胞的成熟及抗體分泌可顯著影響甚至逆轉(zhuǎn)表觀遺傳治療的療效，并提出基于體液免疫阻斷以及表觀遺傳治療的聯(lián)合治療方案為新型腫瘤免疫治療策略提供理論依據(jù)[65]。2017年研究人員首次在單細(xì)胞水平上對(duì)肝癌微環(huán)境中T細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)肝癌內(nèi)存在大量腫瘤組織特異的克隆增生的耗竭性T細(xì)胞，而且在耗竭性CD8+T細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)了一類FOXP3+抑制性T細(xì)胞的存在，揭示了肝癌中T細(xì)胞的亞群分類、發(fā)展軌跡和分布[66]。

1.6 DC

DC 是人體最重要的抗原呈遞細(xì)胞，通過向淋巴組織中沒有接觸過抗原的T細(xì)胞以抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）復(fù)合體的形式呈遞捕獲的抗原并激發(fā)免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)MHC Ⅱ和共刺激因子CD80/86的表達(dá)，遷移到區(qū)域淋巴結(jié)，并與T細(xì)胞相互作用并激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[67]。研究[68]發(fā)現(xiàn)肝癌組織內(nèi)漿細(xì)胞樣DC是原發(fā)性肝癌切除術(shù)后的不良預(yù)后因素，瘤內(nèi)浸潤(rùn)的DC可能通過誘導(dǎo)由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-17產(chǎn)生免疫致炎性腫瘤微環(huán)境，與肝癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)在肝癌中富集cDC1、cDC2和LAMP3+DC 3個(gè)DC亞群，LAMP3+DC是從腫瘤遷移到淋巴結(jié)的更成熟的DC形式，可通過CCL19-CCR7、CCL22-CCR4和CD86-CD28等多條信號(hào)途徑發(fā)揮作用，提示LAMP3+DC與T細(xì)胞功能障礙有關(guān)[12]。此外，有研究[69]提示CD14+DC表達(dá)高水平的CTLA-4，并通過誘導(dǎo)IL-10和吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）表達(dá)抑制T細(xì)胞效應(yīng)。當(dāng)前以DC 為基礎(chǔ)的免疫治療是腫瘤生物免疫治療中最有前景和最有價(jià)值的治療方法之一，因此，如何調(diào)控DC的免疫功能使其發(fā)揮抗腫瘤作用將是未來(lái)研究的方向。

1.7 肝癌微環(huán)境的非細(xì)胞組分

肝癌微環(huán)境中各種細(xì)胞分泌的炎性因子、趨化因子以及ECM等非細(xì)胞組分均參與肝癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等不同過程[70-71]。我們與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）合作，通過分析伴有與不伴轉(zhuǎn)移肝癌的癌周肝組織基因表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)其中最重要的是細(xì)胞免疫、炎癥應(yīng)答相關(guān)基因，而且伴轉(zhuǎn)移的癌周肝組織存在明顯細(xì)胞因子應(yīng)答和炎癥反應(yīng)失衡（Th1/Th2 shift）。利用17個(gè)癌周肝組織炎癥免疫因子的轉(zhuǎn)移及免疫分子預(yù)測(cè)標(biāo)簽可以很好的預(yù)測(cè)肝癌患者的生存和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[72]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步經(jīng)過臨床大樣本驗(yàn)證，證實(shí)癌旁肝組織中IL-2和IL-15、M-CSF表達(dá)與肝癌進(jìn)展、復(fù)發(fā)相關(guān)，其表達(dá)水平可預(yù)測(cè)早期肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和生存[73-74]。此外發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6可通過OPN調(diào)控肝癌干性、促進(jìn)轉(zhuǎn)移[75]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12及其受體CXCR7、CXCR4可促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與肝癌進(jìn)程、新生血管形成、EMT及不良預(yù)后等密切相關(guān)[76-77]，CCL2在肝癌患者中表達(dá)水平可作為肝癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)因子[77]。而且趨化因子也可通過招募免疫細(xì)胞影響免疫應(yīng)答，如CCR4可招募中性粒細(xì)胞參與轉(zhuǎn)移前龕的形成、進(jìn)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[78]；CCR6-CCL20可通過招募Treg促進(jìn)肝癌進(jìn)展和不良預(yù)后[79]。另外，ECM在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞表達(dá)多種ECM蛋白成分使得腫瘤組織結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)程[80]。利用瞬時(shí)彈性成像技術(shù)檢測(cè)肝組織硬度，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中肝組織硬度明顯增加，而且肝組織硬度與肝癌進(jìn)展相關(guān)[81]。同時(shí)基質(zhì)支撐可為腫瘤起始細(xì)胞提供有利壁龕，促進(jìn)肝癌增殖、化療抗性和去分化[82]。而且在肝癌轉(zhuǎn)移前壁龕的形成過程中，ECM還可為免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn)提供機(jī)械支撐[83]。因此阻斷肝癌細(xì)胞炎癥因子、趨化因子相關(guān)的信號(hào)通路，可有效抑制肝癌進(jìn)程。

2 肝癌免疫治療策略

近年，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的腫瘤免疫治療取得突破性進(jìn)展[84]，為腫瘤的治療帶來(lái)了新的曙光。免疫療法的出現(xiàn)為肝癌治療提供了新的選擇，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼細(xì)胞療法（adoptive cell transfer，ACT）、腫瘤疫苗以及細(xì)胞因子治療等。

2.1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑

免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞功能的耗竭，恢復(fù)免疫識(shí)別和免疫攻擊，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑靶點(diǎn)主要包括程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）及其受體PD-1（programmed cell death protein 1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）[85]。PD-1 是CD28 家族的一員，表達(dá)于大多免疫細(xì)胞表面，主要在CD8+T 細(xì)胞上表達(dá)。其可與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合導(dǎo)致抑制性信號(hào)傳遞到T細(xì)胞并誘導(dǎo)耐受[86]。PD-L1在多種腫瘤包括肝癌中異常表達(dá)，腫瘤細(xì)胞可通過異常表達(dá)PD-L1或PD-L2獲得免疫逃逸[87]。2017年9月23日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了納武單抗（nivolumab，PD-1單抗）在晚期肝癌中的二線治療[88]。截止目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)在肝癌領(lǐng)域進(jìn)行了多項(xiàng)探索性研究。隨著CheckMate 040、KEYNOTE-240、KEYNOTE-224和SHR-1210 等研究結(jié)果陸續(xù)發(fā)布，派姆單抗（pembrolizumab，PD-1單抗）、阿特利珠單抗（atezolizumab，PD-L1單抗）已相繼被國(guó)內(nèi)外多個(gè)指南納入并推薦作為肝癌的臨床治療選擇。作為我國(guó)自主研發(fā)的PD-1抑制劑——卡瑞利珠單抗（艾瑞卡?）是我國(guó)首個(gè)獲批肝癌適應(yīng)證的PD-1抑制劑。今年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）指南的二線治療更是將nivolumab、pembrolizumab、卡瑞利珠單抗3 種PD-1抑制劑，共同提升到了 I級(jí)推薦（2A級(jí)證據(jù)）。CTLA-4是CD28家族的另一個(gè)成員，主要在活化的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達(dá)，與B7分子結(jié)合后參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)[64]。伊匹單抗（ipilimumab）和替西木單抗（tremelimumab）均為CTLA-4抑制劑，其中ipilimumab是首個(gè)獲FDA批準(zhǔn)，最早應(yīng)用于臨床的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。2013年臨床試驗(yàn)表明tremelimumab可以有效發(fā)揮抗肝癌作用[89]。隨著對(duì)CTLA-4抗體藥物的作用機(jī)制的深入研究，有學(xué)者認(rèn)為CTLA-4抗體藥物的作用機(jī)理并不是免疫檢查點(diǎn)假說，而是通過靶向清除腫瘤內(nèi)Treg發(fā)揮治療效果[90-91]。目前臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示單用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的患者應(yīng)答率較低，因此免疫檢查點(diǎn)抑制劑與其他治療方式的聯(lián)合應(yīng)用將是未來(lái)方向。

2.2 過繼細(xì)胞療法（ACT）

ACT是一種以利用腫瘤患者自身免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療。分離腫瘤患者體內(nèi)免疫活性細(xì)胞，通過細(xì)胞因子刺激、體外培養(yǎng)或腫瘤抗原負(fù)載，在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增和功能鑒定，再回輸至患者體內(nèi)，增強(qiáng)免疫功能，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。與抗體或其他靶向藥物相比，ACT可以在體內(nèi)激活和增殖，具有持久抗腫瘤作用，因此ACT又被稱為是一種“活”的治療方法[92]。對(duì)于肝癌來(lái)說，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokines induced killer cells，CIKs）和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是主要的治療策略。CIKs是人的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在IL-2、IFN-γ和抗CD3單抗存在條件下體外擴(kuò)增產(chǎn)生的異質(zhì)性免疫細(xì)胞群[93]，由自然殺傷T（natural killer T，NKT）細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL組成，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞溶解活性，與MHC限制性無(wú)關(guān)。CIKs可清除殘余癌細(xì)胞，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，用于放化療無(wú)效的患者。肝癌的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，CIKs治療可提高患者的總生存率（overall survival，OS）和無(wú)瘤生存率（disease free survival，DFS），具有相當(dāng)?shù)寞熜94-96]。但由于CIKs細(xì)胞因子相關(guān)的不良反應(yīng)以及存在免疫逃逸機(jī)制和缺乏特定腫瘤抗原，該療法仍未廣泛應(yīng)用于臨床[97]。CAR-T免疫療法是一種利用基因工程技術(shù)修飾患者T細(xì)胞使其能夠表達(dá)嵌合抗原受體CAR以特異性識(shí)別并殺死癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，是目前ACT治療的研究熱點(diǎn)。CAR-T細(xì)胞療法已在血液系統(tǒng)腫瘤中獲得成功，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞已獲FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于急性B淋巴細(xì)胞白血病及某些B細(xì)胞淋巴瘤的治療[98]。但由于實(shí)體瘤缺乏特異性靶點(diǎn)且易受腫瘤微環(huán)境的影響，關(guān)于肝癌的CAR-T療法仍處于研究階段[99]。目前，主要以磷脂酰肌醇聚糖（glypican-3，GPC3）為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞已證實(shí)能清除GPC3高表達(dá)的肝癌[100]。近日，全球首個(gè)靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞治療晚期肝癌的I期臨床研究結(jié)果公布，治療的安全性和有效性均獲得了令人期待的結(jié)果。接受該治療后患者耐受性良好、安全基本可控，罕見嚴(yán)重毒副反應(yīng)，并初步顯示出較好的臨床獲益[101]。

2.3 治療性腫瘤疫苗

腫瘤疫苗是將腫瘤抗原以多種形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，克服免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)免疫原性，進(jìn)而激活患者自身免疫系統(tǒng)來(lái)治療腫瘤的免疫療法。2010年，provenge（普列威）成為首款被FDA批準(zhǔn)上市的前列腺癌抗腫瘤疫苗。目前，用于肝癌的腫瘤疫苗主要包括多肽疫苗、DC疫苗和溶瘤病毒疫苗。目前多肽疫苗報(bào)道較多的是AFP多肽疫苗和GPC3多肽疫苗。AFP是一種被廣泛用作肝癌患者的血清標(biāo)志物[102],因在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)使其成為基于疫苗治療的一個(gè)有前途的靶點(diǎn)[103]。早期用肝癌-AFP多肽疫苗進(jìn)行的臨床研究體現(xiàn)較好的抗腫瘤活性[103-105]。一項(xiàng)肝癌的I期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPC3肽疫苗具有良好的耐受性，可檢測(cè)到顯著的免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用，并延長(zhǎng)患者總體生存時(shí)間[106]。目前在肝癌中發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤抗原，但僅針對(duì)AFP、GPC-3和MRP3的疫苗表現(xiàn)出良好的耐受性和安全性，這些疫苗的特異性T細(xì)胞應(yīng)答率超過70%。相比之下，針對(duì)NY ESO-1、SSX-2、MAGE-A和TERT肽疫苗的T細(xì)胞應(yīng)答率低于40%[107]。在一些回顧性研究以及I、II期臨床研究中，DC疫苗被應(yīng)用于晚期肝癌患者并在部分患者中體現(xiàn)出對(duì)于腫瘤的免疫應(yīng)答[108-109]。JX-594是目前臨床試驗(yàn)中與肝癌相關(guān)的主要溶瘤病毒，來(lái)源于痘苗病毒疫苗株，在癌細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制并裂解，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示它是安全的[110]。目前，有兩項(xiàng)與JX-594相關(guān)的晚期肝癌的III期臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中（NCT02562755，NCT03071094）。盡管肝癌治療性腫瘤疫苗顯示良好的臨床應(yīng)用前景，但其臨床應(yīng)用仍需更多的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其療效及安全性。

2.4 干擾素和其他細(xì)胞因子治療

目前，一些具有免疫細(xì)胞激活功能的細(xì)胞因子在腫瘤中被廣泛研究，以發(fā)展?jié)撛诘拿庖呒せ顒┖涂鼓[瘤藥物。干擾素α（IFN-α）是FDA批準(zhǔn)第一個(gè)應(yīng)用于腫瘤免疫治療的藥物[111]，能抑制病毒誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)，具有抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的特性[112]。近年不少研究發(fā)現(xiàn)IFNs有預(yù)防病毒性肝炎相關(guān)肝癌發(fā)生及肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的作用。本課題組通過對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，根治性切除的肝癌患者術(shù)后長(zhǎng)期使用長(zhǎng)效干擾素能夠有效延長(zhǎng)患者生存，推遲復(fù)發(fā)[113]。一項(xiàng)Meta分析顯示，干擾素輔助治療可提高肝癌患者治療性腫瘤疫苗術(shù)后總生存率，同時(shí)可降低部分治療患者術(shù)后復(fù)發(fā)率[114]。目前研究及報(bào)道較多的是干擾素聯(lián)合化療栓塞治療預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者術(shù)后給予干擾素聯(lián)合化療栓塞較單純化療栓塞組術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯降低。盡管干擾素作為抗腫瘤藥物的一線地位逐漸被取代，但在肝癌領(lǐng)域，IFN-α的新型制劑長(zhǎng)效聚乙二醇化IFN-α（PEG-IFN-α）則繼續(xù)扮演著重要的輔助用藥角色。臨床前研究發(fā)現(xiàn)干擾素β（IFN-β）除了抗病毒作用外，也可通過JAK-STAT信號(hào)途徑和p53蛋白兩條途徑發(fā)揮抗腫瘤活性[115]。此外，IL-2對(duì)免疫系統(tǒng)也具有多效性作用，可以增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖并激活其抗腫瘤作用。對(duì)于無(wú)法手術(shù)的肝癌患者，經(jīng)IL-2治療后，患者的生存率有所提高[116]。這些結(jié)果提示肝癌中干擾素和其他細(xì)胞因子治療具有良好的免疫治療應(yīng)用前景。

3 肝癌免疫治療面臨的挑戰(zhàn)與展望

近年來(lái)免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域取得重大突破，其在肝癌中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注，但目前仍面臨著療效不確定性、客觀緩解率低、不良反應(yīng)多、甚至患者獲益之后仍可出現(xiàn)耐藥抵抗等問題。因此，如何改善腫瘤免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，基于分子分型指導(dǎo)肝癌免疫治療方案的選擇及聯(lián)合治療等有效提高免疫治療療效，讓更多的肝癌患者從中獲益，是肝癌精準(zhǔn)治療亟待解決的問題和未來(lái)發(fā)展方向。

3.1 肝癌免疫治療面臨的挑戰(zhàn)

盡管免疫療法經(jīng)取得令人欣喜的成果且已批準(zhǔn)用于肝癌的治療選擇。然而，單用PD-1/PD-L1抗體的客觀反應(yīng)率很少超過40%，而且nivolumab與pembrolizumab在肝癌中的客觀反應(yīng)率也未超過20%[117]。目前認(rèn)為免疫治療客觀緩解率低的主要原因在于耐藥的產(chǎn)生[118]。免疫治療的耐藥是一個(gè)復(fù)雜、多機(jī)制相互依賴的動(dòng)態(tài)過程，包括腫瘤內(nèi)免疫浸潤(rùn)受損、T細(xì)胞耗竭、免疫抑制細(xì)胞（Treg、MDSC）募集、表觀遺傳改變等原因。此外，免疫相關(guān)不良反應(yīng)也是影響免疫治療廣泛應(yīng)用的重要原因[119]。如免疫檢查點(diǎn)抑制劑可引起炎癥性不良反應(yīng)，包括垂體炎、甲狀腺功能障礙和糖尿病。靶向CTLA4免疫治療的患者對(duì)垂體炎的易感性增加，而靶向PD1與原發(fā)性甲狀腺功能不全有關(guān)，少數(shù)病例表現(xiàn)為I型糖尿病[120]。而CAR-T治療的重大缺陷是副作用，如細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性等，而且有7%～9%的患者由于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)失敗而不能接受CAR-T治療。另外，免疫治療特異性靶點(diǎn)的選擇、如何保證ACT細(xì)胞更有效的到達(dá)腫瘤部位以及如何抵抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制等也是肝癌等實(shí)體瘤的免疫治療過程中面臨的挑戰(zhàn)[4]。因此，免疫治療的安全性、療效及選擇合適的靶抗原是肝癌免疫治療成功的關(guān)鍵，也是肝癌免疫治療應(yīng)用于臨床之前必須解決的問題。

3.2 以肝癌免疫治療為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療

肝癌處于復(fù)雜的免疫微環(huán)境中，目前單一免疫療法具有較低的緩解率和生存率，特別是Checkmate-459 III期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明nivolumb對(duì)不可切除肝癌的治療效果并未優(yōu)于索拉非尼，免疫治療沖擊肝癌一線治療藥物的首次嘗試宣告失?。∟CT02576509）[121]。因此，針對(duì)肝癌免疫治療研究的重點(diǎn)也逐漸轉(zhuǎn)向多靶點(diǎn)聯(lián)合治療。近期，臨床III期試驗(yàn)IMbrave150相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明atezolizumab聯(lián)合抗血管生成藥貝伐珠單抗（bevacizumab）顯著降低晚期不可手術(shù)切除的肝癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，且明顯改善患者生存質(zhì)量，成為首個(gè)不可切除的晚期肝癌的一線聯(lián)合治療方案[122]。該“T+A”免疫聯(lián)合療法是目前全球公認(rèn)的一線治療方案，也是CSCO 指南推薦的唯一一個(gè)一線首選（Ⅰ級(jí)專家推薦）免疫治療方案。另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)KEYNOTE-524旨在評(píng)價(jià)肝癌靶向治療一線藥物侖伐替尼（lenvatinib）聯(lián)合帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療不可切除的肝癌，今年ASCO最新數(shù)據(jù)顯示，該聯(lián)合方案對(duì)肝癌的客觀緩解率高達(dá)46%，但其臨床應(yīng)用還有待于III期臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步證實(shí)。此外，肝癌靶向治療藥物卡博替尼聯(lián)合Atezolizumab的COSMIC-312III期臨床研究也在進(jìn)行中。目前，雙腫瘤免疫療法相關(guān)的臨床研究也在不斷開展，Check Mate 040是評(píng)估nivolumab聯(lián)合ipilimumab的治療效果，提示針對(duì)不同靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合使用可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)（NCT01658878），目前該雙免疫療法已正式獲FDA批準(zhǔn)用于既往接受過索拉非尼治療的肝癌的患者。PD-L1單抗德瓦魯單抗（durvaluamb）聯(lián)合tremelimumab一線治療晚期肝癌的臨床研究也正在進(jìn)行中（NCT03298451）。同樣，免疫治療與局部治療如消融、放療、栓塞、化療栓塞或放射性栓塞的聯(lián)合應(yīng)用也可促進(jìn)抗腫瘤免疫治療療效。研究[123]發(fā)現(xiàn)，接受射頻消融治療的晚期肝癌患者使用tremelimumab治療后腫瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的積聚增加且中位生存期提高至13個(gè)月。射頻消融術(shù)聯(lián)合序貫細(xì)胞免疫治療可提高肝癌患者無(wú)進(jìn)展生存期[124]。另外，卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案FOLFOX4的III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。目前，多項(xiàng)免疫治療與局部治療聯(lián)合的臨床實(shí)驗(yàn)也已啟動(dòng)以評(píng)估其安全性、耐受性和療效（NCT03143270、NCT02837029、NCT02821754、NCT01853618），有待進(jìn)一步研究結(jié)果。因此，針對(duì)免疫治療開展的聯(lián)合干預(yù)有助于探索新型的有效治療策略，給肝癌患者帶來(lái)更加持久的生存獲益，可能成為未來(lái)腫瘤治療的發(fā)展方向。

3.3 肝癌分子分型與免疫治療

異質(zhì)性是影響實(shí)體腫瘤療效的根本原因[125]，肝癌被認(rèn)為是異質(zhì)性最強(qiáng)的實(shí)體瘤之一[126]，因此，不同的肝癌人群對(duì)免疫治療療效存在顯著差異。大量研究[127-128]提示PD-L1表達(dá)水平、TIL豐度、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）等可以預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效。另外，有研究[129]發(fā)現(xiàn)基于腫瘤中心和邊緣T細(xì)胞浸潤(rùn)頻率和分布模式以及相關(guān)免疫基因的表達(dá)水平可建立肝癌微環(huán)境評(píng)分系統(tǒng)，對(duì)免疫治療具有一定的指導(dǎo)意義。例如基于腫瘤微環(huán)境評(píng)分可將肝癌分為免疫激活型、免疫耗竭型和免疫豁免型。對(duì)于免疫激活型，因腫瘤中心部位有一定量的特異性T細(xì)胞，利用免疫檢查點(diǎn)抑制劑可有效恢復(fù)T細(xì)胞的殺傷活性并取得顯著的抗腫瘤療效；免疫豁免型因缺乏特異性T細(xì)胞，需要通過放療、ACT、溶瘤病毒等方法促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)；免疫耗竭型則主要通過誘導(dǎo)T細(xì)胞歸巢、打破T細(xì)胞浸潤(rùn)屏障的治療策略提升抗腫瘤免疫反應(yīng)[130]。近期基于中國(guó)人群中肝癌的蛋白組學(xué)的分析結(jié)果顯示，肝癌患者中常攜帶的馬兜鈴酸的突變“指紋”與TMB、腫瘤新抗原、微環(huán)境免疫耐受（如CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)、PD-L1等免疫檢查點(diǎn)豐度）顯著相關(guān)，提示該類患者可能從免疫治療中獲益[131]。因此切實(shí)有效的肝癌分子分型是指導(dǎo)精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。

3.4 肝癌“免疫正常化”療法

一直以來(lái)，癌癥免疫治療的基本策略是利用抗腫瘤免疫反應(yīng)，人們主要致力于激活和增強(qiáng)免疫反應(yīng)以消除腫瘤，包括癌癥疫苗、細(xì)胞因子、CAR-T等治療方法。但這種“免疫增強(qiáng)”的治療策略常常導(dǎo)致一系列副作用——免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events，irAEs）。目前針對(duì)PD-1/PD-L1途徑的癌癥免疫療法取得了較高的客觀療效且irAEs較少見，這種方法基于免疫逃逸的機(jī)制，使得抗腫瘤免疫反應(yīng)失而復(fù)得，故稱之為“免疫正?；悲煼╗132]。該治療手段強(qiáng)調(diào)了在腫瘤進(jìn)展過程中識(shí)別免疫反應(yīng)的特定缺陷或功能障礙并據(jù)此糾正這些缺陷且恢復(fù)天然的抗腫瘤免疫能力的重要性。由于肝癌是高度免疫抑制性腫瘤，故“免疫正?；悲煼ㄔ诟伟┲委熤星熬皬V闊。目前除靶向PD-1/PD-L1外，靶向微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞相關(guān)的通路或靶點(diǎn)如：CSF1/CSF1R、IDO、T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3 （T lymphocyte immunoglobulin mucin 3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）等途徑也可糾正肝癌誘導(dǎo)的免疫缺陷，促使免疫正?；痆19,133-134]。但目前上述相關(guān)靶點(diǎn)仍處于相應(yīng)的臨床前研究階段。

4 結(jié) 語(yǔ)

盡管目前針對(duì)肝癌的免疫治療已取得一定成果，但仍面臨著客觀緩解率低和治療不良反應(yīng)等挑戰(zhàn)。因此，從基因突變、基因表達(dá)、細(xì)胞因子/趨化因子和腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞等方面進(jìn)行綜合分析，為肝癌患者制定個(gè)性化的精準(zhǔn)免疫治療方案，有效評(píng)估和預(yù)測(cè)免疫治療的療效及采取聯(lián)合治療策略等，是在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代背景下亟需回答的問題，也是肝癌免疫治療研究的未來(lái)趨勢(shì)。