鄭赫

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV) 傳播途徑廣泛,且感染率極高［1］,患者一旦感染此病毒,隨著時(shí)間推移會(huì)逐漸發(fā)展為急性肝炎、慢性肝炎,嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展成為肝硬化等疾病,給患者身心都帶來很大傷害［2］。如果可以及時(shí)診斷出乙肝病毒是否感染,可以通過治療有效緩解患者痛苦,并降低傳染率［3］。目前臨床上用于此項(xiàng)鑒定的方法主要有ELISA法,其可以對(duì)乙肝病毒感染性標(biāo)志物進(jìn)行定性分析,但是無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。CLIA 法有效結(jié)合了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng),其具有靈敏度高可以快速定量分析的優(yōu)勢(shì),從而彌補(bǔ)了ELISA 法存在的缺陷［4］。本文詳細(xì)分析了 ELISA 法和CLIA 法對(duì)乙肝病毒血清標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017 年10 月～2018 年12 月收治的300 例乙肝患者作為研究對(duì)象,其中男180 例,年齡18～77歲,平均年齡(45.43±12.6)歲；女120例,年齡18～74歲,平均年齡(44.43±12.3)歲。所有患者均符合《WS299-2008乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 離心機(jī)(型號(hào)：SV-II,山東博科科學(xué)儀器有限公司)、全自動(dòng)酶免分析儀(型號(hào)：Bosal,上海通達(dá)生物科技有限公司)、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)儀(型號(hào)：HISCL-5000,日本希森美康公司)。

1.2.2 試劑 ①ELISA 試劑盒：HBsAg(武漢博士康生物工程有限公司,國 藥準(zhǔn)字3400915,批 號(hào)C20161124、C20161125、C20161126)；HBeAg(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司,國 藥準(zhǔn)字3400525,批 號(hào)201609381、201609382、201609383)；HBeAb(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司,國藥準(zhǔn)字3400526,批號(hào)201610121、201610123),HBsAb(武漢博士康生物工程有限公司,國藥準(zhǔn)字3400526,批號(hào)201610181、201610184),HBcAb(武漢博士康生物工程有限公司,國藥準(zhǔn) 字3400526,批 號(hào)201610036、201610027)；②CLIA 劑盒：HBsAg(希森美康株式會(huì)社,國械注進(jìn)20183401932,批號(hào)ZS8114、ZS8116)；HBeAg(希森美康株式會(huì)社,國械注進(jìn)20183401629,批號(hào)EG2012、EG2014)；HBeAb(希森美康株式會(huì)社,國械注進(jìn)20183401671,批號(hào)EB2011、EB2013)；HBsAb(希森美康株式會(huì)社,國械注進(jìn)20183402425,批號(hào)SB2016、SB2018)；HBcAb (希森美康株式會(huì)社,國械注進(jìn)20183401669,批號(hào)CB2014、CB2016)。

1.3 方法

1.3.1 血清處理 抽取患者早餐空腹靜脈血,隨后使用離心機(jī)于3500 rpm 離心15 min 后分離出血清。

1.3.2 ELISA 法 采用ELISA 試劑盒以及酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),一定要嚴(yán)格按照試劑盒說明及酶標(biāo)儀的儀器說明進(jìn)行操作,正式樣品測(cè)定同時(shí)要測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為最終的參照,質(zhì)控選取定值參比血清,標(biāo)本分別測(cè)定 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 共5 項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 CLIA 法 采用CLIA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè),嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行,測(cè)定指標(biāo)與ELISA 方法相同,同樣需要測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為最終的參照,質(zhì)控選取定值參比血清。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比、分析ELISA 法及CLIA法乙肝病毒感染性標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果。①ELISA 的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)定值≥上限參考值；HBsAg 參考值上限為0.2 ng/ml,HBsAb 上限參考值為10.0 mIU/ml,HBeAg 上限參考值為0.05 NCU/ml、HBeAb 上 限 參 考 值 為2.0 NCU/ml、HBcAb 的上限參考值為1.5 NCU/ml［4］。②CLIA 的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：測(cè)定值≥上限參考值,其測(cè)定參考值同①。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 標(biāo)準(zhǔn)樣本的回收率均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi),此次檢測(cè)有效。300 例患者中,ELISA 法檢測(cè)HBsAg 陽性198 例(66.00%),HBsAb 陽性115 例(38.33%),HBeAg 陽 性247 例(82.33%),HBeAb 陽 性289 例(96.33%),HBcAb 陽 性221 例(73.67%)；CLIA 法 檢 測(cè)HBsAg 陽 性231 例(77.00%),HBsAb 陽 性161 例(53.67%),HBeAg 陽 性289 例(96.33%),HBeAb 陽 性290 例(96.67%),HBcAb 陽 性257 例(85.67%)。兩種方法HBeAb 陽性檢出率對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CLIA 法HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAb陽性檢出率高于ELISA 法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果分析 本次檢測(cè)中,兩種方法檢測(cè)同時(shí)為陽性：HBsAg 198 例,HBsAb 115 例,HBeAg 247 例、HBeAb 289 例、HBcAb 221 例；CLIA 法檢測(cè)為陽性但ELISA法檢測(cè)為陰性：HBsAg 33 例,HBsAb 46 例,HBeAg 42 例,HBeAb 1 例,HBcAb 36 例。CLIA 法檢測(cè)陽性的HBsAg 33 例中有32 例屬于低水平測(cè)定結(jié)果(平均值為0.3 ng/ml),HBsAb 46 例有40 例屬于低水平測(cè)定結(jié)果(平均值為10.5 mIU/ml),HBeAg 42 例有39 例屬于低水平測(cè)定結(jié)果(平均值為1.06 NCU/ml),HBcAb 36 例有35 例屬于低水平測(cè)定結(jié)果(平均值為1.52 NCU/ml)。當(dāng)測(cè)定值顯著大于上限值時(shí),ELISA 方法與 CLIA 法的陽性檢出率基本一致,CLIA 方法的檢出限顯著低于ELISA 法,低濃度時(shí)其敏感度更高。

3 討論

乙肝病毒是引起乙肝的病原體,其屬于嗜肝DNA 病毒科,該科病毒包含正嗜肝DNA 病毒屬和禽嗜肝DNA 病毒屬,引起人體感染的是正嗜肝DNA 病毒屬。乙肝病毒的感染是目前難以解決的全球性的公共衛(wèi)生問題之一。其主要傳染源為急性乙肝患者、慢性乙肝患者和乙型肝炎病毒攜帶者,乙型肝炎病毒感染者的血液無論是處于潛伏期還是急性期或慢性期都具有傳染性［5］。HBsAg 陽性持續(xù)6 個(gè)月以上,沒有肝炎癥狀的體征,肝功能等各項(xiàng)檢查都顯示正常,血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)均在正常范圍,肝組織檢查顯示沒有明顯的異常癥狀稱為乙肝病毒攜帶者。慢性患者和病毒攜帶者作為傳染源的意義最大,其傳染性與病毒復(fù)制或體液中乙肝病毒的DNA 含量呈正比［6］。乙肝病毒主要的傳播途徑是血液傳播,其次是母嬰傳播,乙肝患者中通常有40%～50%的患者均來源于母嬰傳播,再次是密切接觸傳播,最后是醫(yī)源性傳播,如消毒不徹底、不安全注射等。

乙肝病毒的主要致病機(jī)理與肝細(xì)胞受損程度以及機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱有關(guān),當(dāng)病毒致機(jī)體免疫應(yīng)答低下時(shí),一旦發(fā)生乙肝病毒感染對(duì)外膜抗原的體液抗體應(yīng)答利于清除血液中的病毒顆粒,對(duì)核殼和復(fù)制酶抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答清除病毒的同時(shí)也損害肝細(xì)胞。其次,病毒變異產(chǎn)生耐藥性時(shí),病毒會(huì)發(fā)生變異后的免疫逃逸,乙肝病毒在感染過程中由于人體免疫壓力和抗乙肝病毒藥物的影響易誘發(fā)變異,乙肝病毒變異后,可造成病毒不易清除并引起耐藥,降低抗病毒治療的療效。最后,抗體介導(dǎo)的免疫病理損害如HBsAb、前S1 抗體(PreS1-Ab)和前S2 抗體(PreS2-Ab)可直接清除血循環(huán)中游離的病毒,但抗原抗體形成的免疫復(fù)合物可沉積于腎小球基底膜、關(guān)節(jié)滑液囊等處并激活補(bǔ)體,引起Ⅲ型超敏反應(yīng),從而導(dǎo)致急性肝壞死,表現(xiàn)為重癥肝炎［7］。

常用的乙肝病毒感染的檢測(cè)指標(biāo)即乙肝5 項(xiàng)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb,可以在很大程度上反映被檢者體內(nèi)乙肝病毒水平及機(jī)體的反應(yīng)情況,粗略評(píng)估病毒的水平［8］。乙肝五項(xiàng)檢測(cè)分為定性和定量?jī)煞N,定性檢查只能提供陰性或陽性結(jié)果,定量檢查則可提供各項(xiàng)指標(biāo)的精確數(shù)值,對(duì)乙肝患者的監(jiān)測(cè)、治療評(píng)估和預(yù)后判斷等方面有更重要的意義,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可作為臨床醫(yī)師制定治療方案的依據(jù)。

ELISA 法就是一種定性的方法,其反應(yīng)機(jī)理是試劑可以使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性,使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA 可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。其重要的試劑種類為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體以及酶作用的底物(顯色劑)。CLIA 包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)同時(shí)發(fā)射出光子(hM),利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標(biāo)記在抗原(稱為CLIA)或抗體(稱為免疫化學(xué)發(fā)光分析)上,或酶作用于發(fā)光底物。因此其反應(yīng)原理的不同導(dǎo)致了其具有不同的靈敏度和檢測(cè)限。除去反應(yīng)原理不同,兩種方法檢測(cè)過程也有很大區(qū)別,ELISA 法中手動(dòng)加樣、孵育時(shí)間的確定以及手動(dòng)洗板等因素可能會(huì)因?yàn)槿藛T手法的不同從而導(dǎo)致結(jié)果具有差異性。

綜上所述,CLIA 法檢測(cè)分析檢測(cè)乙肝病毒感染性標(biāo)志物時(shí)敏感度更高,檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。