摘? ?要： 為了獲得高純度非達(dá)霉素樣品，以非達(dá)霉素粗品為起始原料，基于高效液相色譜法，開(kāi)發(fā)非達(dá)霉素的分離純化工藝，考察不同的流動(dòng)相、填料和上樣量對(duì)非達(dá)霉素保留與分離的影響，并進(jìn)行分離條件優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)：甲酸水/乙腈體系和C8-3填料對(duì)非達(dá)霉素的保留及雜質(zhì)的去除情況較好;當(dāng)上樣量為0.8%時(shí)，雜質(zhì)的去除效果良好。優(yōu)化后，放大到制備水平，以C8-3為固定相，以甲醇為洗脫劑，對(duì)非達(dá)霉素粗品進(jìn)行分離純化，主峰純度可達(dá)99.24%，回收率約為90.74%，樣品關(guān)鍵雜質(zhì)指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞： 非達(dá)霉素;高效液相色譜;分離純化;C8-3填料;回收率

中圖分類(lèi)號(hào)：O69? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：2095-8412 （2020） 06-050-05

工業(yè)技術(shù)創(chuàng)新 URL： http：//gyjs.cbpt.cnki.net? ? DOI： 10.14103/j.issn.2095-8412.2020.06.009

引言

非達(dá)霉素（fidaxomicin）是由桔橙指孢囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種新型窄譜大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)物質(zhì)[1-4]，分子式為C52H74Cl2O18，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。非達(dá)霉素市場(chǎng)前景廣闊，但目前關(guān)于非達(dá)霉素分離純化的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少[5-6]。

文獻(xiàn)[7]報(bào)道了一種分離純化過(guò)程，包括浸提、大孔樹(shù)脂吸附、萃取、正相柱層析、苯乙烯微球柱、萃取等步驟，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)，容易造成產(chǎn)品出現(xiàn)降解產(chǎn)物，使純度和回收率降低。文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道了先采用有機(jī)溶劑從微生物菌絲中浸提，再用大孔樹(shù)脂和制備柱層析進(jìn)行分離的方法，但是微生物發(fā)酵過(guò)程十分復(fù)雜，而且溶媒浸提會(huì)將菌絲中的油脂與非達(dá)霉素一并提取出來(lái)，這些油脂會(huì)吸附到樹(shù)脂上，使樹(shù)脂交換容量大大降低，需額外增加工藝步驟去除這些雜質(zhì);同時(shí)，再生樹(shù)脂需耗費(fèi)大量溶劑，生產(chǎn)成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，研究高純度非達(dá)霉素的分離純化方法具有重要的意義。

本文以非達(dá)霉素粗品為起始原料，采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），通過(guò)篩選分離材料和優(yōu)化洗脫條件，開(kāi)發(fā)一種非達(dá)霉素的分離純化方法。后續(xù)僅需簡(jiǎn)單結(jié)晶，即可獲得高質(zhì)量的非達(dá)霉素產(chǎn)品。該方法操作簡(jiǎn)便，獲得的樣品純度較高，回收率穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 儀器、試劑與材料

實(shí)驗(yàn)所需要的儀器包括S6000液相色譜系統(tǒng)（華譜科儀（北京）科技有限公司）和DAC 50-HB純化系統(tǒng)（江蘇漢邦科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)所需要的色譜柱及色譜填料均購(gòu)于浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司。

分析水平所用甲醇和乙腈為色譜純，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;磷酸二氫鉀、甲酸和甲酸銨為分析級(jí)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

制備水平所用甲醇為工業(yè)級(jí)甲醇，水為純化水。

非達(dá)霉素粗品來(lái)自浙江野風(fēng)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 色譜條件

1.2.1 樣品分析參數(shù)

色譜柱為Unitary C18（4.6 mm×100 mm，3 μm）;流動(dòng)相A為乙腈，B為50 mM磷酸二氫鉀;洗脫條件為等度洗脫，A/B=50/50（V/V）;流速為0.5 mL/min;柱溫為15℃;波長(zhǎng)為230 nm;進(jìn)樣量為2 μL。

1.2.2 流動(dòng)相優(yōu)化考察

色譜柱為C8-1（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液，C為50 mM甲酸銨（pH～6）水溶液，D為50 mM甲酸銨（pH～3）水溶液。洗脫條件分別為：1）A/B=7/3（V/V）;2）A/C=7/3（V/V）;3）A/D=7/3（V/V）。流速為1 mL/min;波長(zhǎng)為230 nm;進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.3 填料優(yōu)化考察

色譜柱分別為C8-1、C8-2、C8-3，色譜柱規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，粒徑均為10 μm。

流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;流速為0.7 mL/min;波長(zhǎng)為230 nm;進(jìn)樣量為100 μL。

1.2.4 上樣量考察

色譜柱為C8-3（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;流速為0.7 mL/min;波長(zhǎng)為230 nm;上樣量分別為0.8%、1%。

1.2.5 制備條件

色譜柱為C8-3（50 mm×260 mm，10 m，300 g）;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;沖柱條件為A/B=20/80（V/V）;流速為60 mL/min;波長(zhǎng)為230 nm;上樣量為0.8%

2? 結(jié)果與討論

2.1? 粗品純度分析及質(zhì)量要求

非達(dá)霉素粗品經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，如圖2所示。主峰（20.35 min）純度68.66%，關(guān)鍵雜質(zhì)在18.47 min（相對(duì)保留時(shí)間RRT=0.91）和18.73 min（RRT=0.92）分別為0.03%和0.08%。根據(jù)后續(xù)結(jié)晶工藝水平，結(jié)晶前的粗品要求為RRT=0.91～0.92，雜質(zhì)之和≤0.15%，其他單個(gè)雜質(zhì)≤0.5%。

2.2? 流動(dòng)相優(yōu)化考察

對(duì)于分離工藝來(lái)說(shuō)，流動(dòng)相的選擇需要考慮樣品溶解度、雜質(zhì)的分離選擇性、目標(biāo)物的峰形以及環(huán)保要求等因素。根據(jù)非達(dá)霉素的溶解特性及環(huán)保要求，選擇甲醇作為有機(jī)洗脫劑，考察了酸水以及不同pH的甲酸銨緩沖鹽對(duì)分離的影響，結(jié)果如圖3所示。在pH～6緩沖鹽的條件下，非達(dá)霉素的保留比較弱，峰形拖尾，雜質(zhì)的分離度也不高，不利于分離純化工藝開(kāi)發(fā)。當(dāng)甲醇比例相同時(shí)，非達(dá)霉素在酸性條件下保留和分離較好，添加甲酸或者甲酸銨的差異不大。如果采用pH～3緩沖鹽的條件，需要在后處理過(guò)程中增加脫鹽步驟，增加成本，而甲酸為揮發(fā)性有機(jī)酸，在后處理濃縮過(guò)程中基本去除完全，后處理相對(duì)比較簡(jiǎn)單。后續(xù)通過(guò)繼續(xù)優(yōu)化有機(jī)溶劑的種類(lèi)及洗脫條件，最終選擇0.1%甲酸水溶液/乙腈（53/47，V/V）體系作為分離純化的洗脫條件。

2.3? 填料優(yōu)化考察

填料是分離純化工藝的核心，填料的類(lèi)型及參數(shù)對(duì)雜質(zhì)的分離選擇性、峰展寬、上樣量、回收率等有很大的影響。實(shí)驗(yàn)選取三款填料（C8-1、C8-2、C8-3），采用優(yōu)化好的分離條件，在大進(jìn)樣量情況下進(jìn)行模擬制備，并收集目標(biāo)餾分，檢測(cè)純度，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，在C8-3填料上，雜質(zhì)去除效果最好，合格餾分的回收率最高。

2.4? 上樣量考察

上樣量在分離純化工藝中也是一個(gè)關(guān)鍵因素，關(guān)系到生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本控制。隨著上樣量增加，色譜峰變寬，雜質(zhì)與主峰發(fā)生交叉，從而可能影響主峰與雜質(zhì)的分離度，降低制備樣品的純度[11-12]。因此在放大制備過(guò)程中要選擇合適的上樣量，以便在獲取符合質(zhì)量要求樣品的同時(shí)保證足夠的回收率，從而提高效率，降低成本。

實(shí)驗(yàn)考察了不同上樣量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量以及回收率的影響，結(jié)果如表2所示。當(dāng)上樣量為0.8%時(shí)，雜質(zhì)的去除效果良好，回收率也比較高。當(dāng)上樣量繼續(xù)增加至1%時(shí)，符合質(zhì)量要求餾分的回收率降低。因此，選擇0.8%上樣量是比較合適的。

2.5? 放大制備

經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化以后，在內(nèi)徑為50 mm的制備柱上進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，制備條件如章節(jié)1.2.5所述。制備譜圖如圖4所示。收集53～61 min餾分，檢測(cè)譜圖如圖5所示，主峰純度99.24%，其余雜質(zhì)符合要求，回收率約90.74%。經(jīng)過(guò)放大驗(yàn)證，該方法的分離效果良好，通過(guò)一步結(jié)晶得到了高純度的樣品，操作簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3? 結(jié)束語(yǔ)

本文基于高效液相色譜法，考察了非達(dá)霉素在不同流動(dòng)相條件下和不同色譜填料上的保留與分離的情況，確定了最大上樣量，并放大到制備水平，得到了高純度的非達(dá)霉素樣品。

該方法操作簡(jiǎn)單，分離高效、穩(wěn)定，所得樣品關(guān)鍵雜質(zhì)指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)，回收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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作者簡(jiǎn)介：

周文武（1983—），通信作者，男，浙江溫州人，碩士研究生，工程師。研究方向：發(fā)酵產(chǎn)物后提取及分離純化工藝。

E-mail： zhouwenwu1983@126.com

（收稿日期：2020-09-01）