紀海旺，孫曉榮，孫 科

（1.青島市嶗山區(qū)王哥莊街道辦事處，山東青島 266105；2.青島市嶗山區(qū)農業(yè)農村局，山東青島 266100；3.青島市嶗山區(qū)沙子口街道辦事處，山東青島 266102）

2019年12月以來，由新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引發(fā)的新冠肺炎（COVID-19）疫情在全球暴發(fā)流行，給人類健康、公共衛(wèi)生安全、經濟發(fā)展和社會穩(wěn)定造成了巨大影響。SARS-CoV-2是繼2003年的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS-CoV），2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）后出現的第七個可以導致人類疾病的冠狀病毒。COVID-19的暴發(fā)流行，再次引起了人們對冠狀病毒的關注。目前，在犬群中已經分離獲得了屬于α冠狀病毒屬的犬腸炎冠狀病毒和屬于β冠狀病毒屬的犬呼吸道冠狀病毒。其感染機體后引起的臨床癥狀通常較輕，但易與犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒等可引起腸炎或呼吸道疾病的病原體發(fā)生混和感染。2020年2月，我國香港報道了COVID-19患者家養(yǎng)的寵物犬感染了SARS-CoV-2，表明SARS-CoV-2也對犬健康構成了威脅。本文從病原學與流行病學、臨床癥狀、診斷和防治措施等角度，對犬冠狀病毒進行了綜述，以期為犬冠狀病毒病的綜合防治提供借鑒。

1 病原學與流行病學

犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCoV）屬于巢式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科。目前，感染犬的冠狀病毒主要包括犬腸炎冠狀病毒和犬呼吸道冠狀病毒（canine respiratory coronavirus，CRCoV）。有關CCoV感染的報道首次出現于1971年，德國科學家Binn等從患急性腸炎的軍犬中分離獲得了病毒（1-71株），純化的病毒可實驗感染幼犬并出現相似的臨床癥狀[1]。此后CCoV在世界范圍內多個國家和地區(qū)出現，并成為犬的重要腸道病原體。血清學和病原學研究[2]表明：CCoV在犬群中普遍存在，尤其在犬舍和動物收容所更加流行。國內相關研究人員先后報道了警犬、軍犬、民用犬的冠狀病毒感染[3]。1995年，解放軍農牧大學軍事獸醫(yī)研究所從病犬心臟和胃腸道內容物中分離到CCoV[4]。

目前，腸道CCoV引起自然感染的影響因素尚不完全清楚。CCoV是導致犬腸炎的主要原因之一，感染癥狀從輕度到中度不等，但對幼犬或與其他病原體共感染時癥狀較重。常見癥狀包括糞便稀軟、腹瀉、嘔吐、脫水、食欲不振等，偶爾死亡。CCoV和犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）發(fā)生共感染時，癥狀尤為嚴重，且CCoV也會加重CPV的感染程度[5]。CCoV的自然感染途徑為糞-口傳播，因此感染犬糞便為主要傳染源。在新生犬中，CCoV主要在小腸上皮細胞的絨毛尖端復制，引起裂解性細胞感染。隨后，小腸絨毛縮短或脫落，并在感染后18～72 h導致感染犬發(fā)生腹瀉。局部產生的IgAs可限制CCoV在腸道內的傳播并阻止感染的進展，因此感染犬在臨床癥狀消失后，病毒仍可持續(xù)存在6個月之久[5]。CCoV感染的主要傳染源是發(fā)病犬或帶毒犬，其糞便、唾液可對飼料、飲水、犬舍等造成污染，健康犬科動物經口由消化道感染病毒[6-7]。CCoV感染一年四季均可發(fā)生，但冬季發(fā)生率較高。此外，犬的生活環(huán)境、飼養(yǎng)密度、斷奶、分窩、調運等因素也能誘發(fā)感染或發(fā)病。

與所有RNA病毒一樣，CCoV在復制過程中極易發(fā)生突變，產生毒性更強的毒株并引起更嚴重的腸道疾病。目前除了已知的I型（CCoV-I）和II型（CCoV-II）兩個基因型外，還發(fā)現了新的重組CCoV變異株。CCoV-I型和CCoV-II型S蛋白的同源性只有54%，而兩種基因型共感染情況很常見[8]。CCoV-I與貓冠狀病毒（FCoV-I）由同一種病毒進化而來，但CCoV-I在編碼S蛋白的基因下游，存在獨特的開放閱讀框ORF3（長度為624 nt），而FCoV-I中完全不存在該開放性閱讀框，CCoV-II和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因組中有該閱讀框殘留[9]。此外，在患有腹瀉的犬糞便中還發(fā)現了CCoV-II和TGEV的重組毒株，且廣泛分布。最早分離的CCoV屬于CCoV-II型，根據S蛋白N末端前300個氨基酸區(qū)域（NTD），將CCoVII進一步分為兩個亞型：CCoV-IIa和CCoV-IIb，分別包括經典CCoV和TGEV樣毒株[10]。該分類方法雖沒有被正式接受，但在文獻中已被廣泛應用。CCoV-IIa在犬類中流行最為普遍，且具有與原型CCoV一致的NTD。經典的CCoV-IIa僅限于感染小腸，而新出現的泛嗜性CCoV-IIa可以全身性傳播，引起白細胞減少[11]。CCoV-IIb與CCoVIIa在遺傳學上不同，其S蛋白與TGEV有類似的NTD，這在幾個歐洲國家以及日本均有報道[10]。近年來，鑒于A76樣病毒中新發(fā)現了一種NTD，有研究者建議將其分為一個新亞型——CCoV-IIc。它是具有CCoV-I樣或FCoV-I樣NTD的CCoV-II型病毒。這些病毒在美國和瑞典都有報道[12]。

2003年，英國在病犬中分離到一株屬于β冠狀病毒屬的CCoV，其與牛冠狀病毒相近，但遺傳進化特點又明顯不同，為了與屬于α冠狀病毒屬的犬腸炎冠狀病毒相區(qū)分，將其命名為CRCoV[13]。隨后，日本在家養(yǎng)犬上呼吸道中也分離到了CRCoV。流行病學調查和遺傳進化分析表明，日本、韓國、意大利、加拿大、美國等國家均存在CRCoV感染[14]。

2019年12月以來，SARS-CoV-2在全球流行。2020年2月，我國香港首次報道犬可感染SARSCoV-2。目前，比利時、美國、中國、法國、西班牙、德國、俄羅斯、荷蘭、丹麥等國家已先后報道了犬、貓、圈養(yǎng)獅子和老虎、水貂等多種動物的SARS-CoV-2感染。Thomas等[15]通過熒光定量PCR、血清學、基因組測序、病毒分離等技術研究發(fā)現，15只來自我國香港COVID-19患者家庭飼養(yǎng)的寵物犬中，有2只為SARS-CoV-2陽性。首例SARS-CoV-2感染犬為1只17歲的去勢雄性博美犬。在整個檢疫期間，該犬未出現明顯臨床癥狀，鼻拭子檢測為SARS-CoV核酸陽性，但肛拭子和糞便樣本為陰性，也沒有分離到病毒。另外1只SARS-CoV-2感染犬為2.5歲健康狀況良好的雄性德國牧羊犬。其主人被確診為COVID-19患者后對其進行了檢測，在口、鼻和肛拭子中均檢測到了SARS-CoV-2核酸，同時在口、鼻拭子中分離獲得了病毒。該患者家中的另外1只犬則沒有感染SARS-CoV-2。兩只感染犬體內均檢測到了SARSCoV-2抗體，且病毒核酸序列與其主人體內的一致，在整個檢疫期間均未出現臨床癥狀。以上數據表明，這是典型的人感染犬的病例。目前尚不清楚感染犬是否可將病毒傳染給其他動物，或者再傳染給人類。

2 臨床癥狀及病理變化

犬腸道冠狀病毒感染潛伏期較短，自然感染病例為1～4 d，實驗感染病例通常只有1～2 d。病犬感染3～14 d后可通過糞便排毒。研究表明，自然感染犬的核酸陽性時間可達發(fā)病后6個月（PCR檢測）。CCoV感染后主要引起犬輕度或中度腸炎，主要表現為精神沉郁、食欲減退、嘔吐、嗜睡和腹瀉等。腹瀉通?？沙掷m(xù)數日，糞便呈水樣或粥樣，顏色呈暗紅色、紅色或黃綠色，并混有少量血液或黏液，身體出現脫水癥狀[16-17]。成年犬感染CCoV后通?？勺杂?，很少出現死亡，但幼犬感染后癥狀較為嚴重，甚至出現死亡。目前，CCoV通常與其他病原體，尤其是與CPV等可引起腸炎癥狀的病原體發(fā)生混合感染，導致更嚴重的臨床癥狀，甚至死亡[18-19]。CCoV輕度感染時，病理變化較輕微，在重癥病例中，可發(fā)現腸管膨脹，管壁變薄，充滿水樣、白色或黃綠色糞便。通常，腸系膜淋巴結出現水腫及腫大，并伴有肺多灶性實變以及肝、脾、腎等器官出血變性[20-21]。病例組織學變化通常包括，腸道損傷以及小腸絨毛萎縮和融合，隱窩加深甚至壞死[21]。

雖然CRCoV具有高度傳染性，并可從自然感染犬呼吸道中分離到，但感染犬通常僅表現出亞臨床或較溫和癥狀，且用分離病毒接種易感犬也不能完全復制出臨床癥狀。自然狀態(tài)下，CRCoV感染能否引起臨床癥狀，可能與混合感染和宿主易感性密切相關。目前，尚沒有直接證據證明，CRCoV是犬呼吸道疾病的主要病原體，但其作為潛在病原體的可能性需要加以重視。

3 實驗室診斷

3.1 病原學檢測

病毒的分離、培養(yǎng)是國際公認的病原學診斷的“金標準”。此方法特異性好，但因CCoV較難進行細胞培養(yǎng)，導致其敏感度較低。此外，由于操作復雜、所需時間長、需要特定的試驗條件等因素，限制了其在臨床或基層單位的使用。可用于CCoV分離培養(yǎng)的細胞包括，犬纖維瘤傳代細胞（A72細胞）、原代或傳代犬腎細胞（MDCK細胞）、胸腺滑膜細胞、貓腎細胞（CRFK細胞）等[22]。病毒分離培養(yǎng)后，需要再結合電鏡觀察、中和試驗、間接免疫熒光（IFA）、RT-PCR、序列測定分析等方法進一步鑒定[23]。范泉水等[24]利用雙抗體夾心原理建立了CCoV ELISA檢測方法，可在4 h內完成快速診斷。目前，臨床上采用的CCoV檢測方法主要為免疫膠體金檢測試紙條。此方法操作簡單，無需特殊儀器設備，適合臨床現場快速診斷，但特異性稍差。

3.2 血清學檢測

CCoV感染的血清學診斷主要包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、中和試驗等。研究者利用表達的重組蛋白為包被抗原建立了CCoV抗體間接ELISA檢測方法，對50份陽性血清和陰性血清的復檢準確率為100%[25]。中和試驗是測定血清抗體效價的最有效方法，但因其需要病毒和細胞，操作復雜，且所需時間長，較少用于CCoV感染的診斷。

3.3 分子生物學檢測

3.3.1 RT-PCR PCR/RT-PCR是目前最常用的核酸檢測方法。Takano等[6]利用建立的CCoV RTPCR檢測方法，對收集的101份犬肛拭子樣本進行檢測，發(fā)現CCoV-I和CCoV-II的檢出率分別為88.9%和7.4%。Wang等[26]根據CDV和CCoV的H和M基因序列設計了兩對引物，建立了一步雙重PCR（one-step dPCR）方法，發(fā)現該方法與傳統(tǒng)PCR具有相同的敏感性。

3.3.2 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR） 近年來，qRT-PCR因其敏感性高，且可對目標核酸含量進行實時定量檢測等優(yōu)點，逐漸成為核酸檢測的主流方法。王靜等[27]根據CCoVS基因保守區(qū)域設計特異性引物，建立了CCoV SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其最低檢測限為40～50 copies/μL，靈敏度是常規(guī)RT-PCR檢測方法的10倍。

3.3.3 納米PCR（nano RT-PCR） 納米PCR是應用某些納米材料結合PCR技術而產生的一種新興檢測方法，可以進一步提高檢測的特異性和敏感性[28]。研究者建立了可鑒別CCoV不同基因型的雙重納米RT-PCR檢測方法。該方法對CCoV-I和CCoV-II的最低檢測限分別為6.47×101、6.91×102copies/μL；進一步研究發(fā)現，犬群中CCoV-I和CCoV-II共感染率為8.33%[29]。

4 防治措施

疫苗免疫是預防傳染病的最有效措施。當前用于犬冠狀病毒病免疫預防的疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。無論犬只年齡如何，首次免疫后隔3～4周再次進行兩劑量免疫，并于每年加強免疫1次。CCoV主要通過糞-口接觸傳播，因此科學、合理的飼養(yǎng)管理是預防病毒感染的重要一環(huán)。犬舍應每天打掃，清除糞便。CCoV對高溫、紫外線、甲醛等敏感，可定期對犬舍用1%～10%甲醛溶液或0.1%過氧乙酸溶液進行全面噴灑消毒[23]，對犬類相關用品進行高溫消毒。目前，針對CCoV感染尚沒有有效的治療藥物，臨床治療主要以支持性護理為主，通過消炎、止吐、止瀉補液和平衡體內電解質的方法提高機體抵抗力。

5 結語

進入21世紀以來，冠狀病毒引起了包括急性呼吸綜合征（SARS）、中東呼吸綜合征（MERS）和COVID-19在內的3次大的傳染病暴發(fā)流行，給人類健康和公共衛(wèi)生安全構成了嚴重威脅。CCoV雖然通常只引起輕微的臨床癥狀，但有研究表明一些新的變異毒株也在不斷出現。此外，由于犬也可感染SARS-CoV-2，目前尚不清楚感染犬是否可將病毒再傳染給其他動物或人類。因此，應加強CCoV感染的綜合防治研究，尤其是病原生態(tài)學和疫情監(jiān)測預警。