謝飛 李鵬 溫建民* 孫衛(wèi)東

1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 1001022.北京中醫(yī)藥大學房山醫(yī)院，北京 102400

近年來隨著科學研究的進展，骨科領域的基礎研究轉向了這種既有細胞間通訊功能又有一定的組織修復能力的外囊泡-外泌體(Exosomes)[1]。外泌體是一種具有良好的生物相容性的天然生物納米粒子，直徑為50～120 nm的外囊泡(extracellular vesicles，EVs)[2-3]。外泌體存在于身體的各個角落，如血液、組織液、淚液、唾液、尿液、乳汁、消化液、腦脊液、羊水、腹水等[4-6]，其內可包含DNA、mRNA、microRNA及蛋白質等，最新exocarta庫示，人體內各類細胞來源的外泌體所攜帶的蛋白質已有41 860種蛋白質、脂質1 116種、mRNA 408種、microRNA 2 838種[7-9]。近年來隨著科技進步及細胞生物學的快速發(fā)展，國內外研究機構發(fā)現(xiàn)，骨細胞來源外泌體在骨內的平衡中發(fā)揮著重要作用，而外泌體減少或消失可引起骨質的疏松、骨性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎的發(fā)病[10]。祖國醫(yī)學中醫(yī)藥治療骨損傷歷史悠久，治療骨損傷等疾病一般按照早期采用散瘀活血等基礎治療，再通過推拿或手法復位對斷骨再接和續(xù)筋整復，根據(jù)“腎藏精，骨生髓”的中醫(yī)理論，局部或口服中藥進行補腎造髓，效果顯著。本文綜述近幾年來中西醫(yī)骨科相關的外泌體研究，為進一步探究外泌體調控骨再生機制的研究提供相應的理論基礎。

1 中醫(yī)藥與外泌體

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學博大精深，認為“腎藏精，腎主骨”腎氣的滿衰對骨質有著直接的影響，對于骨損的修復和再生，宜采用補腎類的中藥對癥治療，其作用機理為調節(jié)自體對鈣質的重吸收利用，糾正體內鈣離子、磷離子等微量元素的吸收平衡，進而調節(jié)骨代謝[11]。陳云剛等[12]研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補含藥血清對人骨髓間充質干細胞來源外泌體(BMSCs-exsomes)具有增值作用，通過激活wnt/β-catenin通路，使RUNX-2、LRP5、β-catenin表達上調，GSK-3βmRNA表達下調。Wu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷通過促進人骨髓間充質干細胞來源外泌體可促進成骨分化、加速血管新生，并抑制破骨細胞分化。所以可以認為，補腎類中藥具有一定的修復、促進成骨分化和增值的作用，更有抑制破骨再生等功效。西醫(yī)研究外泌體促進骨再生是從生物分子學等多方面進行研究，并沒有明確的指向性，而中醫(yī)學結合千百年來的中醫(yī)理論為基礎，遵循中醫(yī)理論中“腎主骨”的觀點進行針對性的研究[14]。如崔學軍及朱輝團隊研究發(fā)現(xiàn)，腎與骨在中醫(yī)學理論可視為同源器官，其機理為骨7(BMP-7)與腎1，25(OH)2D3或許為中醫(yī)理論中“腎藏精、骨生髓、腎主骨”的理論基礎[15-16]。中醫(yī)理論中的“腎”是由泌尿系統(tǒng)的多個器官組成，研究各個泌尿系統(tǒng)組織細胞分泌的外泌體與骨組織缺損和再生，可能是研究外泌體促進骨損修復的重要線索，以外泌體作為中醫(yī)藥骨傷治療的突破點，必將開創(chuàng)中西醫(yī)理論研究的嶄新一頁。

2 外泌體調控間充質干細胞

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一種可自我分化及更新再生，具有多項潛能祖細胞，自身可受周圍環(huán)境和機械應力刺激影響分化形態(tài)。MSC分泌LF-6、LIF、M-CSF等來支持造血，更有修復傷損、促進或抑制細胞增值、調節(jié)血管再生、保護神經(jīng)元細胞、免疫抑制及應答等功能[17-18]。近年來已發(fā)現(xiàn)外泌體可調控和誘導MSC分化成骨細胞，Xu等[19]對骨髓間充質干細胞研究時發(fā)現(xiàn)，MSCs作為成骨細胞前體，在成骨誘導發(fā)生時，成骨細胞(osteoblast)外泌體所攜帶的microRNA(let-7a，miR-199b，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-203，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)上調，MSC分化為成骨細胞過程中有5種miRNA下調(miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a、miR-320c)，其中7個mRNA (RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2、Xsox17、DDX6、Lsm2)在BSMC外泌體中具有顯著性表達。同樣有研究發(fā)現(xiàn)[20]，MSCs外泌體中所攜帶的miR-29a、miR-29c誘導MSCs成骨分化，其結果表明Exosomes中miRNA在誘導成骨細胞增值與分化過程中有著不可缺少的功能，而進一步對MSCs來源Exosomes所攜帶miRNAs測序發(fā)現(xiàn)miR-206、miR-196a、miR-27a這3個與成骨相關的miRNA的表達顯著增高。而Qin等[1]和Xie等[21]研究發(fā)現(xiàn)相同，BMSCs來源外泌體內miRNA中Let-7、miR-218、miR-196a、miR-118a的差異表達能夠刺激BMCs向成骨細胞分化。Furuta等[22]研究表明，在小鼠股骨折緩慢愈合的模型中注射骨髓間充質干細胞來源外泌體后可以有效促進骨損愈合，同時分析其中miRNA(miR-21、miR-4532、miR-125b-5p、miR-338-3p)的差異表達及與血管再生因子(MCP-1、MCP-3、SDF-1)的關聯(lián)性。Narayanan團隊[23]發(fā)現(xiàn)成骨分化的MSCs-exosomes可促進TGF-β1、BMP9及RunX2和Osterix表達。同時Hao團隊[24]發(fā)現(xiàn)，Exosomes所含miR-320c可將MSCs誘導分化成軟骨細胞，Cosenza團隊[25]證實小鼠MSCs外泌體刺激體內免疫系統(tǒng)抵抗關節(jié)囊內炎癥發(fā)展，延緩軟骨退化進程，從而維穩(wěn)軟骨形態(tài)平衡?？梢姽撬栝g充質干細胞Exosomes所攜帶的核酸通過調控Wnt等誘導成骨形成，保護骨細胞的作用，研究不同類型細胞的Exosomes的調控機制仍需要深入研究。

3 外泌體與成骨細胞

成骨細胞(osteoblasts)占骨細胞的4%～6%，是MSC前體細胞，主要的功能是沉積鈣鹽和成骨，骨的重塑和生長發(fā)育與成骨細胞密不可分。外泌體可通過所攜帶microRNA調節(jié)成骨細胞增值，進而影響成骨細胞相關mRNA表達。Qin等[1]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs來源Exosomes可誘導成骨細胞轉化，其中miR-196a表達最顯著，miR-206、miR-27a次之，提示MSCs來源Exosomes為骨再生主要發(fā)生因素。Inder等[26]研究發(fā)現(xiàn)，人成骨細胞經(jīng)前列腺癌細胞外泌體調控后活性增加1.5倍。而Kyoko等[27]在Inder的研究基礎上進一步發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者中骨形成時會導致成骨細胞的損傷，而這種損傷可導致骨骼結構變的更薄，甚至骨折，進而促進了腫瘤的生長。Cui等[28]發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1來源Exosomes通過所攜帶miRNA使Axinl、β-catenin表達抑制，進而誘導并促進向成骨分化。同時Xu等[29]發(fā)現(xiàn)，肌肉和骨骼能夠互通有無是通過C2C12細胞外泌體中miRNA(miR-27a-3p)調控并激活MSCs中MC3T3-E1通路來實現(xiàn)誘導并加速成骨細胞分化，該發(fā)現(xiàn)從一個新的角度詮釋肌肉骨骼的相互轉化的可能性。Xie等[21]研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎的成骨細胞前體細胞外泌體所攜帶miRNA中(miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p)上調抑制成骨細胞分化，而Let-7、miR-335-3P、miR-378b、miR-677-3p促進成骨細胞和MSCs成骨分化。Sato團隊[30]將小鼠骨細胞清除后發(fā)現(xiàn)所含外泌體中microRNAs更有30條差異性表達，更說明外泌體不僅可促進成骨分化，更具有調控血液內各類細胞的功能。

4 外泌體與破骨細胞

骨細胞來源干細胞中的高分化多核巨細胞，主要功能降解骨量和吸收骨基質，骨吸收與骨內微循環(huán)來維持骨穩(wěn)態(tài)，人體內只有破骨細胞(osteoclast)可參與骨吸收，它與成骨細胞(osteoblast)協(xié)同合作，在骨再生平衡中發(fā)揮作用，若破骨細胞相對活躍容易造成骨質損失進而導致骨質疏松癥的發(fā)生，反之骨量會增多[31-32]。而研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞能夠調控骨量的平衡的機制在于其所產(chǎn)生的外泌體中的miRNA，其中miR-214具有破壞并抑制成骨細胞的功能，同時發(fā)現(xiàn)破骨細胞來源外泌體利用ephrinA2/EphA2的特性將miR-214/miR-214-3p精準的釋放入成骨細胞中，從而降低成骨細胞的分化能力[33]。Li等[34]同樣研究發(fā)現(xiàn)miR-214-3p的高表達與骨量的減少及骨質疏松癥的發(fā)生存在著直接聯(lián)系。Frassanito團隊[35]發(fā)現(xiàn)骨髓基質金屬蛋白酶(BMMs)培養(yǎng)的EPCs分泌外泌體進入培養(yǎng)基，與EPCs相比，外泌體具有更高的LncRNA MALAT1表達水平。該團隊證實LncRNA MALAT1直接與miR124結合，負調控miR124活性。此外，miR124的過表達可以逆轉EPC來源外泌體誘導的BMMs的遷移和破骨分化。雙熒光素酶re波特實驗表明，整合素ITGB1是miR 124的靶點。與單用BMMs治療的小鼠相比，采用EPC衍生外泌體BMM co移植的小鼠骨折部位新生血管增大，骨折愈合增強，結果表明EPC來源的外泌體可以通過LncRNA MALAT1促進破骨細胞前體的募集和分化，ITGB1的3′-UTR中存在一個潛在的miR-124結合位點，miR-124和ITGB1之間可相互作用，當miR-124 mRNA水平增加時，ITGB1水平降低。整合素參與多種與破骨細胞形成相關的功能，包括基質識別、細胞骨架組織和基質衍生信號，而激活失敗β1整合蛋白與破骨細胞功能障礙有關。Deng等[36]發(fā)現(xiàn)，骨溶解為骨髓瘤(MM)的主要臨床癥狀，患者往往疼痛難忍，造成其主要原因為骨髓中漿細胞病變引起的復制擴張，破壞了成骨細胞和破骨細胞穩(wěn)定的骨態(tài)平衡，其最主要的原因是MM患者所含5TGM1細胞來源Exosomes中所攜帶誘導致使巨噬細胞向破骨細胞分化，導致破骨細胞活性增強，同時成骨細胞由于Wnt通路下調而抑制分化(外泌體所攜帶DKK-1至Collagen1A1、Osterix和RUNX2減少)，進而抑制和死亡。

5 總結與展望

外泌體是一群異質性的細胞來源的膜結構物質，其介導細胞之間的溝通和相互作用。這表明骨細胞可以自發(fā)地分泌含有蛋白質、脂質和核酸的外泌體，然后調節(jié)破骨細胞生成和骨生成。然而，外泌體在骨穩(wěn)態(tài)中的調節(jié)活性網(wǎng)絡以及它們在骨損傷中的治療潛力仍然有許多未知之處。本文總結近幾年來外泌體在骨再生方面的研究進展，目前較多的研究發(fā)現(xiàn)外泌體廣泛參與骨損傷的修復和再生。外泌體作為細胞間通訊的媒介，但其參與細胞間選擇性通訊和交流的具體機制仍是未解之謎，目前的研究表明骨來源的外泌體是骨細胞之間細胞間通訊的介質。外泌體介導的骨細胞之間的核酸或蛋白質的轉移可以越過不同細胞之間的空間屏障，并且在調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的骨細胞之間的相互作用中起重要作用。應更深入地進行外泌體相關課題的研究，以期今后為臨床治療骨疾病提供相應的理論依據(jù)及行之有效的治療方法。