周琳 楊明理 曾春平* 龍濤 樊秀云

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州醫(yī)科大學(xué)第五臨床學(xué)院，廣東 廣州 5107002.遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563000

骨重建包括骨形成和骨吸收兩種相互平衡的過程，分別由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞調(diào)控[1]。破骨細(xì)胞的過度作用導(dǎo)致骨吸收增多，打破骨形成和骨吸收的平衡，將引起如骨質(zhì)疏松癥等疾病，破骨細(xì)胞在這類疾病中的作用非常關(guān)鍵[2]。目前發(fā)現(xiàn)，各型糖尿病使骨質(zhì)疏松癥發(fā)病風(fēng)險增高[3]。運用降糖藥物降低血糖后，骨折風(fēng)險可明顯降低，這些降糖藥物中，二甲雙胍降低骨折風(fēng)險最為明顯，且矯正了降糖的作用后，二甲雙胍仍具有降低骨折風(fēng)險的作用[4]。目前的研究表明，二甲雙胍通過促進成骨細(xì)胞分化[5-7]，增強成骨細(xì)胞的功能來增加骨密度，然而二甲雙胍對破骨細(xì)胞的作用罕見有文獻報道。本課題組研究鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞分化及功能的作用，從而為骨質(zhì)疏松癥提供潛在的治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自澳大利亞 TRACE 公司，RANKL、MCSF、TRAP試劑盒購自北京索萊寶公司，鹽酸二甲雙胍(純度>98%)購自美國Sigma公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自美國santo cruz公司。抗ERK抗體購自美國cell signaling公司。骨吸收板購自美國BD公司。TRIZOL購買于美國invitrogen公司，Real-time PCR反應(yīng)試劑SYBR?Premix Ex Taq購于大連TaKaRa。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

分離取出C57BL/6小鼠股骨的骨髓巨噬細(xì)胞種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶內(nèi)含10 mL 10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基和25 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d至后種于96孔板中，每孔6 000個細(xì)胞，含100 μL完全培養(yǎng)基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL。同時加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L)，每2 d換一次培養(yǎng)液，總共培養(yǎng)5 d。5 d后細(xì)胞固定30 min，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染料(TRAP)染色15 min，然后用10倍鏡下數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)量(對細(xì)胞核大于3的破骨細(xì)胞進行計數(shù))。

1.3 破骨細(xì)胞骨吸收活性檢測

在6孔膠質(zhì)板上用RANKL誘導(dǎo)C57BL/6小鼠骨髓巨噬細(xì)胞成為成熟的破骨細(xì)胞，消化獲取細(xì)胞后種于覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板上，每孔1×105個細(xì)胞，含2 mL完全培養(yǎng)基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(200、400 μmol/L)。培養(yǎng)48 h后，取一半細(xì)胞進行TRAP染色，另一半細(xì)胞用10%的漂白液洗去培養(yǎng)板上的細(xì)胞，然后用顯微鏡對骨吸收陷窩進行拍照，并用Image J 計算骨吸收面積。

1.4 破骨細(xì)胞基因檢測

用實時熒光定量PCR檢測破骨細(xì)胞特異基因。小鼠骨髓巨噬細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×105個細(xì)胞，含2 mL完全培養(yǎng)基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(100、200 μmol/L)。隔天換液，培養(yǎng)5 d，然后用TRIZOL裂解細(xì)胞。用1 μg 總RNA通過oligo-dT引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR?Premix Ex Taq于實時熒光定量RT-PCR儀進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測破骨細(xì)胞基因的擴增情況。針對小鼠基因序列的引物設(shè)計如下：Cathepsin K(forward：5’-GGGAGAAAAACCTGAAG-3’；reverse： 5’-ATTCTGGGGACTCAGAGAGC-3’)；Calcitonin Receptor (forward： 5’-TGGTTG AGGTTGT GCCCA-3’；reverse：5’-CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3’)；TRAP (forward： 5’-TGT GGCCAT CTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3’)。實時熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 40 s并進行30個循環(huán)，接著60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，最后72 ℃ 5 min。

1.5 Western blot 分析

小鼠骨髓巨噬細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×105個細(xì)胞，含2 mL完全培養(yǎng)基、25 ng/mL MCSF，然后加入鹽酸二甲雙胍(200 μmol/L)處理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分別刺激0、5、10、20、30、60 min后棄去培養(yǎng)基，并提取細(xì)胞裂解液。然后用相應(yīng)抗體檢測二甲雙胍對ERK磷酸化的影響。并用NBT/BCIP顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，Image J分析蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行數(shù)據(jù)分析。實驗組與各自的對照組進行兩兩比較，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞分化的影響

本實驗通過C57BL/6小鼠股骨分離出的骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)分化成破骨細(xì)胞并進行TRAP染色來進行研究鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞分化的影響。本實驗采用濃度為6.25～400 μmol/L的鹽酸二甲雙胍進行干預(yù)破骨細(xì)胞的分化。研究表明，鹽酸二甲雙胍能抑制破骨細(xì)胞分化，且這種抑制呈濃度依耐性。鹽酸二甲雙胍從50 μmol/L的濃度開始抑制破骨細(xì)胞分化，IC50在100 μmol/L(圖1)。

圖1 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞分化的作用 A：鹽酸二甲雙胍的分子結(jié)果(分子式：C4H12ClN5，分子量：165.6246)；B：不同濃度鹽酸二甲雙胍干預(yù)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)板的掃描圖片；C：100倍顯微鏡下觀察不同濃度鹽酸二甲雙胍干預(yù)破骨細(xì)胞分化；D：對鹽酸二甲雙胍干預(yù)的破骨細(xì)胞進行計數(shù)(對細(xì)胞核大于3的破骨細(xì)胞進行計數(shù))。Fig.1 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast differentiation. A: The molecular structure of metformin hydrochloride (molecular formula: C4H12ClN5, molecular weight: 165.6246); B: The scanned picture of the cell culture plate interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; C: Microscopy (100×) observation of osteoclast differentiation interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; D: Calculation of osteoclasts interfered by metformin hydrochloride (osteoclasts with cell nucleus≥3 will be calculated only).

2.2 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞功能的影響

鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞功能的影響通過覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板來進行研究。本實驗用鹽酸二甲雙胍干預(yù)破骨細(xì)胞骨陷窩的形成，然后用顯微鏡對骨吸收陷窩進行拍照，并用Image J計算骨吸收面積。結(jié)果表明，鹽酸二甲雙胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制骨吸收陷窩，且這種抑制呈濃度依耐性(圖2)，因此對破骨細(xì)胞的功能有抑制作用。

圖2 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞功能的作用，采用覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板上分析鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞陷窩的作用Fig.2 The effect of metformin hydrochloride on the function of osteoclasts, hydroxyapatite-coated plates were applied for the study of the effect of metformin hydrochloride on osteoclast lacunae

2.3 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞特異基因的影響

本實驗用實時熒光定量PCR檢測鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞特異基因的影響。用不同濃度的鹽酸二甲雙胍(100、200 μmol/L)干預(yù)破骨細(xì)胞分化，然后檢測破骨細(xì)胞特異基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)的表達情況。結(jié)果表明，鹽酸二甲雙胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制破骨細(xì)胞特異基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)，且這種抑制呈濃度依耐性(圖3)。該結(jié)果與鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞的分化及功能具有抑制作用的結(jié)果相符合。

圖3 鹽酸二甲雙胍對破骨細(xì)胞特異基因的作用Fig.3 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast specific genes

2.4 鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的影響

本實驗用Western blot檢測鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的影響。鹽酸二甲雙胍(200 μmol/L)處理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分別刺激0、5、10、20、30、60 min后棄去培養(yǎng)基，并提取細(xì)胞裂解液進行Western blot分析。結(jié)果表明鹽酸二甲雙胍能抑制ERK的磷酸化(圖4)。

圖4 鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的作用Fig.4 The effect of metformin hydrochloride on the phosphorylation of ERK

3 討論

隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為影響全球人口生活質(zhì)量和生命健康安全的重要疾病。因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致髖骨骨折患者1年內(nèi)的死亡率可以提高8.4～36個百分點[8]。骨質(zhì)疏松癥所導(dǎo)致的骨折給患者帶來極大的痛苦，給患者和家庭乃至整個社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上治療骨質(zhì)疏松的藥物如雙膦酸鹽對胃腸道有較大的刺激；甲狀旁腺激素需每天經(jīng)皮下注射，且費用昂貴；補充鈣劑和維生素D3對骨質(zhì)疏松的療效并不明顯。因此，尋求抗骨質(zhì)疏松療效顯著，副作用小，且能夠長期使用的藥物對改善骨質(zhì)疏松癥患者的生活質(zhì)量意義重大。

鹽酸二甲雙胍是目前治療糖尿病的一線藥物，具有高效性及低副作用性。目前的文獻報道鹽酸二甲雙胍除了降糖作用，還具有抗炎、抗腫瘤、降血脂及心臟保護等作用[9]。鹽酸二甲雙胍近來還被發(fā)現(xiàn)在糖尿病骨質(zhì)疏松模型大鼠及糖尿病性骨質(zhì)疏松癥患者中均具有抑制骨質(zhì)疏松，提高骨密度，降低骨折風(fēng)險的作用[10-11]。目前研究表明二甲雙胍通過促進成骨細(xì)胞分化，增強成骨細(xì)胞的功能來增加骨密度[5-7]，然而二甲雙胍對破骨細(xì)胞的作用罕見有文獻報道。本實驗表明鹽酸二甲雙胍隨濃度升高對破骨細(xì)胞的分化及功能具有抑制作用，該作用與抑制ERK磷酸化有關(guān)。綜上所述，本研究為鹽酸二甲雙胍應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療提供了研究基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。