楊雅焯，汪 迎，李 輝，莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095)

六堡茶是一種后發(fā)酵緊壓茶，具有獨(dú)特的檳榔香味，因“紅、濃、陳、醇”的風(fēng)味品質(zhì)和清血管、助消化、降“三高”等保健功能而得到國(guó)內(nèi)外愛(ài)茶人士的認(rèn)可[1-2]。沱茶有別于其他茶類，屬再加工茶中的緊壓茶，為重慶和云南特有，主要分為云南沱茶、普洱沱茶和重慶沱茶3種。重慶沱茶一般選用中上等曬青、烘青和炒青毛茶為原料，然后進(jìn)行搭配、篩分、整形、拼堆、稱料、蒸壓成型、干燥等工序，其成品茶形似碗臼，色澤烏黑油潤(rùn)，湯色澄黃明亮，滋味醇厚甘和[3]。

緊壓茶的后發(fā)酵過(guò)程里，由于溫度、濕度等原因，微生物大量生長(zhǎng)繁殖。這些微生物在代謝活動(dòng)中，為了滿足自己對(duì)碳、氮的需求，會(huì)分泌胞外酶，分解、轉(zhuǎn)化和降解纖維素、果膠等茶葉內(nèi)含物，從而形成緊壓茶的獨(dú)特滋味成分[4]。六堡茶特有色香味的形成，就是蛋白質(zhì)、茶多酚等物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中，由于水分、溫度及有益微生物的綜合作用，發(fā)生水解、糖解和氧化聚合等物理和化學(xué)變化而形成的[5]。傳統(tǒng)沱茶以大葉種為原料、曬青為主要原料，搭配炒青、小量烘青，中小葉種調(diào)節(jié)滋味，同樣需要一個(gè)后發(fā)酵過(guò)程[3]。因此，緊壓茶生產(chǎn)及加工過(guò)程中所產(chǎn)生的有益微生物對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。

不同產(chǎn)地的緊壓茶微生物群落組成有所不同[6-7]。云南普洱茶的菌株種類主要以霉菌和酵母菌為主[9]；湖南茯磚茶的主要微生物有冠突散囊菌屬(Crytospora)、黑曲霉、青霉屬等[9]；四川康磚茶的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌為葡萄球菌屬(Staphyloccus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，霉菌優(yōu)勢(shì)菌為黑曲霉屬、青霉屬、灰綠霉屬等[6]。六堡茶發(fā)酵時(shí)綠麹菌、灰霉菌、毛菌、白羽菌等真菌會(huì)促進(jìn)茶多酚氧化水解，但是若干霉菌如黑霉菌則會(huì)使發(fā)酵茶產(chǎn)生惡劣氣味[10]；重慶沱茶的微生物群落組成目前尚不清楚。有益微生物的生長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)緊壓茶品質(zhì)，但是雜菌的出現(xiàn)則會(huì)破壞緊壓茶的風(fēng)味質(zhì)量，影響其保健功能。因此，提高緊壓茶品質(zhì)及安全性則顯得至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)緊壓茶進(jìn)行微生物多樣性分析，可以為優(yōu)化緊壓茶微生物群落結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定其品質(zhì)提供幫助[9]。目前，關(guān)于利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)廣西六堡茶和重慶沱茶中微生物菌群分布情況的分析還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序，利用ITS和16S rDNA序列測(cè)定方法分析了兩種不同緊壓茶中真菌及細(xì)菌群落組成。初步探討了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物組成差異，為尋找和利用緊壓茶中的優(yōu)勢(shì)菌，提高緊壓茶的品質(zhì)和安全性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取緊壓茶廣西六堡茶和重慶沱茶為試驗(yàn)材料，兩者均為2017年生產(chǎn)的成品茶。分別編號(hào)為WY1(廣西六堡茶)和WY2(重慶沱茶)。對(duì)每個(gè)樣品取樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 緊壓茶樣品微生物總DNA的提取

參照Omega微生物總DNA提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)的使用說(shuō)明對(duì)緊壓茶樣品進(jìn)行微生物總DNA的提取。

1.3 PCR擴(kuò)增

真菌ITS檢測(cè)選用的擴(kuò)增引物為ITS1F-ITS2R(ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[11]。細(xì)菌16S檢測(cè)選用的擴(kuò)增引物為515F-907R(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，907R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[12]。對(duì)提取的緊壓茶微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化后的PCR產(chǎn)物。

1.4 測(cè)序

緊壓茶樣品微生物總DNA ITS和16S rDNA測(cè)序由南京集思惠遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

對(duì)高通量測(cè)序檢測(cè)到的數(shù)據(jù)與已有的ITS區(qū)和16S區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。對(duì)檢測(cè)到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾拼接，獲得有效序列[13]。利用R語(yǔ)言中的函數(shù)來(lái)制作OTU維恩圖和微生物群落組成的柱狀分析圖。利用Muthur軟件計(jì)算Chao-1指數(shù)和聚類分析圖，相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照Omega微生物總DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明對(duì)緊壓茶樣品微生物進(jìn)行總DNA提取，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)每個(gè)樣品純化后的PCR產(chǎn)物。真菌檢測(cè)的ITS序列長(zhǎng)度為600bp，細(xì)菌16S rDNA測(cè)定的序列片段長(zhǎng)度為460 bp，圖1表明，獲得與預(yù)期大小相符的條帶。

2.2 OTU(Operational Taxonomic Units)韋恩圖分析比較

維恩圖展示了廣西六堡茶和重慶沱茶共有的OTU數(shù)及各自特有的OTU數(shù)(圖2)。廣西六堡茶特有的真菌OTU數(shù)為18，重慶沱茶特有的真菌OTU數(shù)為87。兩樣品的真菌OTU總數(shù)為138，重合的OTU數(shù)為33，占總數(shù)的24%，且重慶沱茶有較多特有的真菌類群。細(xì)菌類群中，廣西六堡茶特有的OTU數(shù)為265，重慶沱茶特有的OTU數(shù)為20。兩者的OTU總數(shù)為403，相同的OTU數(shù)為118，重復(fù)率為29%，且廣西六堡茶的特有細(xì)菌類群遠(yuǎn)大于重慶沱茶。

2.3 真菌和細(xì)菌多樣性分析

廣西六堡茶和重慶沱茶微生物多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。廣西六堡茶的真菌群落為2門、8綱、11目、12科、14屬，細(xì)菌群落為11門、20綱、38目、71科、99屬。重慶沱茶的真菌群落為2門、5綱、5目、3科、4屬，細(xì)菌群落為8門、16綱、23目、43科、48屬。Chao-1指數(shù)是反映物種豐富度的綜合指標(biāo)，Chao-1指數(shù)越大，物種豐富度越高；Shannon 指數(shù)與群落多樣性成正比，Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高。由表1可知，重慶沱茶真菌的物種豐富度大于廣西六堡茶，群落多樣性則小于廣西六堡茶，而其細(xì)菌的物種豐富度及群落多樣性都小于廣西六堡茶。

圖1 廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細(xì)菌PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products from fungi and bacteria in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas注：A:真菌；B:細(xì)菌。M:Marker；WY1:廣西六堡茶；WY2:重慶沱茶。下同。

圖2 廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細(xì)菌OTU維恩圖Fig.2 Fungal and bacterial OTU Venn diagrams of Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

表1 廣西六堡茶和重慶沱茶的微生物多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 真菌和細(xì)菌物種變化分析

豐度分布曲線反映了兩種緊壓茶隨著OTU數(shù)量的增加，真菌及細(xì)菌物種豐富程度和均勻程度的變化(圖3)。當(dāng)OTU數(shù)量較少時(shí)，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細(xì)菌豐度曲線斜率較大，物種豐富程度和均勻程度較差。隨著OTU數(shù)量的增加，曲線逐漸平緩。重慶沱茶的真菌豐度曲線寬度大于廣西六堡茶，且其真菌豐度曲線比廣西六堡茶的平坦。因此，重慶沱茶的真菌物種豐富程度和均勻程度均高于廣西六堡茶。廣西六堡茶的細(xì)菌豐度曲線寬度大于重慶沱茶且其細(xì)菌豐度曲線比重慶沱茶的平坦，說(shuō)明廣西六堡茶的細(xì)菌物種豐富程度和均勻程度均高于重慶沱茶。

圖3 廣西六堡茶和重慶沱茶中真菌及細(xì)菌豐度分布曲線Fig.3 Distribution of fungal and bacterial abundance in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5 不同分類水平下微生物菌落分析

2.5.1 門分類水平下兩個(gè)樣品真菌及細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)分析 門分類水平下，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖4。廣西六堡茶的真菌菌落主要是子囊菌門(Ascomycota)，占比90.1%。重慶沱茶的真菌菌落主要是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)，子囊菌門(Ascomycota)占比最大，為80.78%。廣西六堡茶的細(xì)菌菌落主要是放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)占比最大，為49.96%。重慶沱茶的細(xì)菌菌落主要是變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)，藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)占比最大，為91.45%。

圖4 廣西六堡茶和重慶沱茶門分類水平下的真菌及細(xì)菌Fig.4 Fungal and bacterial phyla found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5.2 廣西六堡茶和重慶沱茶中真菌及細(xì)菌的菌落屬結(jié)構(gòu)分析 屬分類水平下，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖5。廣西六堡茶的真菌菌落主要是Blastobotrys，占比3.57%。重慶沱茶的真菌菌落主要是青霉屬(Penicillium)和煙管菌屬(Bjerkandera)，煙管菌屬(Bjerkandera)占比最大，為16.85%。廣西六堡茶的細(xì)菌菌落主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、Saccharopolyspora和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)，其中Saccharopolyspora占比最大，為47.45%。重慶沱茶的細(xì)菌菌落占比較低。

圖5 廣西六堡茶和重慶沱茶屬分類水平下的真菌及細(xì)菌Fig.5 Fungal and bacterial genera found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5.3 真菌物種豐度聚類分析 屬分類水平下對(duì)廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌物種豐度進(jìn)行聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖6。廣西六堡茶和重慶沱茶相對(duì)豐度較高的真菌相差較大。廣西六堡茶的真菌優(yōu)勢(shì)菌為Blastobotrys，重慶沱茶的真菌優(yōu)勢(shì)菌為纖孔菌屬(Bjerkandera)、青霉屬(Penicillium)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)。重慶沱茶的真菌優(yōu)勢(shì)菌豐度高于廣西六堡茶。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)在茶樹(shù)基因組[14]、轉(zhuǎn)錄組[15-16]、小RNA組[17-18]、微生物[19-20]等領(lǐng)域取得較大的進(jìn)展。本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物菌群組成和多樣性，發(fā)現(xiàn)Blastobotrys是六堡茶的真菌優(yōu)勢(shì)菌，鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、Saccharopolyspora、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)是六堡茶的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌。這與溫志杰等檢測(cè)到六堡茶在渥堆過(guò)程中不僅有真菌，也存在著大量細(xì)菌的結(jié)果相接近[21]。徐書澤利用高通量技術(shù)對(duì)成品六堡茶進(jìn)行真菌多樣性研究時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了Blastobotrys的存在[22]。纖孔菌屬(Bjerkandera)、青霉屬(Penicillium)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)為重慶沱茶的真菌優(yōu)勢(shì)菌，但是并沒(méi)有檢測(cè)到其明顯的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群。在整個(gè)緊壓茶茶類中，對(duì)沱茶的微生物研究極少，目前對(duì)重慶沱茶微生物菌群的研究還未見(jiàn)報(bào)道。重慶沱茶與下關(guān)沱茶的加工工藝相似，Li等通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)與新一代測(cè)序(NGS)對(duì)下關(guān)沱茶微生物豐度和多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中，微生物主要是真菌，且霉菌占主要優(yōu)勢(shì)，這與我們?cè)谥貞c沱茶中發(fā)現(xiàn)的微生物組成種類大致相近[23]。

圖6 在屬分類水平上廣西六堡茶和重慶沱茶真菌聚類圖Fig.6 Cluster analysis on fungal genera found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

結(jié)合本試驗(yàn)中的OTU維恩圖，多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果，豐度分布曲線和聚類圖等分析結(jié)果表明：重慶沱茶的真菌物種豐富度和均勻度均高于廣西六堡茶，而細(xì)菌物種豐富度及均勻度則低于廣西六堡茶，微生物群落多樣性低于六堡茶，且無(wú)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群。這種差異可能與六堡茶及重慶沱茶的加工工藝有關(guān)，兩種茶皆有毛茶初制、精制、拼配、蒸壓、干燥和陳化等基本工序，不同的是，六堡茶多了“渥堆”的關(guān)鍵工藝。渥堆時(shí)，由于溫度、濕度、養(yǎng)分適宜的原因，微生物大量繁殖，理想的生長(zhǎng)環(huán)境為微生物多樣性創(chuàng)造了良好條件，除真菌外，還有大量細(xì)菌的存在[21]。除此之外，由于兩者的產(chǎn)地不同，氣候條件不同，在茶葉干燥時(shí)，六堡茶使用的是晾置干燥，而重慶沱茶由于產(chǎn)地空氣濕度較大，則會(huì)選擇低溫慢烘，不同的環(huán)境條件和干燥工藝可能會(huì)增加重慶沱茶真菌的物種豐富度[3,24]。六堡茶在陳化階段，隨著陳化進(jìn)行，真菌多樣性會(huì)呈現(xiàn)一個(gè)先降低后升高的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中，六堡茶真菌物種豐富度和均勻度低于重慶沱茶，也可能是由于取樣時(shí)兩者處于不同的陳化階段所造成的差異[25]。

本研究通過(guò)提取廣西六堡茶和重慶沱茶成品茶的微生物總DNA，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較了兩種緊壓茶的微生物組成及多樣性，初步探討了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物組成差異，為尋找和利用緊壓茶中的優(yōu)勢(shì)菌，提高緊壓茶的品質(zhì)和安全性提供了一定的理論依據(jù)。高通量測(cè)序技術(shù)可以簡(jiǎn)化研究步驟，縮短研究周期，快速得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[26-27]，但是由于測(cè)序的分子片段較短，無(wú)法在種水平上進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，若要進(jìn)一步分析緊壓茶中各種微生物對(duì)其品質(zhì)形成的作用，仍需結(jié)合傳統(tǒng)分離技術(shù)加以研究[25]。