苗佳，王彩喆，牛丹丹，Nokuthula Peace Mchunu，田康明*，Suren Singh，Kugenthiren Permaul，王正祥*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457) 3(Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria 0001, South Africa) 4(Department of Biotechnology & Food Technology, Durban University of Technology, Durban 4001, South Africa)

海藻糖(Trehalose, α-D-glucopyranosyl-α- D-glucopyranoside)是由兩個葡萄糖殘基組成的非還原性二糖，天然存在于低等植物、細(xì)菌、真菌、昆蟲及無脊椎動物中[1-3]。在冷凍、干燥、加熱等逆性環(huán)境下，海藻糖被認(rèn)為能夠與生物大分子形成氫鍵或在其周圍形成玻璃質(zhì)，從而起到保護(hù)作用，是新型食品加工與保鮮的重要保護(hù)劑[4-5]。海藻糖在保存脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子以及干細(xì)胞、組織和器官等方面的應(yīng)用，也受到研究者的關(guān)注[6]。

海藻糖的定量分析是對其進(jìn)行研究和應(yīng)用的技術(shù)基礎(chǔ)。目前常用的海藻糖定量分析方法包括比色法、高效液相色譜(HPLC)法和酶法。比色法是基于蒽酮與碳水化合物的顏色反應(yīng)進(jìn)行定量，不具有特異性[7-8]。HPLC法是目前定量分析海藻糖的主要方法，但其對樣品處理要求較高，且受特定設(shè)備條件限制[9-14]。酶法檢測利用海藻糖酶特異性水解海藻糖生成兩分子葡萄糖，通過對反應(yīng)過程參數(shù)[12]或?qū)ζ涿附猱a(chǎn)物葡萄糖的檢測[13, 15-18]而間接定量海藻糖，是亟待發(fā)展的海藻糖快速簡便檢測方法。

ANTONLLI等[14 ]使用海藻糖酶、己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，通過檢測NADPH生成量間接定量海藻糖，檢測限可達(dá)6.3 μmol/L；NEVES等[16]使用海藻糖酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，依據(jù)染料吸光度變化測定生成的O2，以此定量海藻糖檢測限可達(dá)50 μmol/L。此類方法特異性高，操作相對簡便，但較高的用酶成本限制其推廣應(yīng)用。

鑒于葡萄糖快速定量檢測技術(shù)已經(jīng)十分成熟，以固定化酶微電極為基礎(chǔ)的葡萄糖生物傳感分析儀已在我國發(fā)酵、食品研究及生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。為此，本文在前期獲得優(yōu)秀海藻糖酶酶分子的基礎(chǔ)上，利用海藻糖酶對海藻糖的專一水解，結(jié)合葡萄糖生物傳感分析儀對海藻糖水解產(chǎn)物的快速定量檢測，建立起一種海藻糖快速檢測方法，并就其檢測特征與可能的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司；海藻糖酶(120 u/mL，一個酶活力單位定義為在pH 4.0和55 ℃條件下，每分鐘水解1 μmol海藻糖所需的酶量)為本實(shí)驗(yàn)室前期制備與保存，另文發(fā)表；所用的其他化學(xué)品均為分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli) B0013-1031H、JC31和JC41，為本課題組前期構(gòu)建。B0013-1031H 菌株的乙酸、乳酸、甲酸和琥珀酸的合成途徑被阻斷[19]，在此基礎(chǔ)上，刪除海藻糖分解途徑獲得突變株JC31，進(jìn)一步強(qiáng)化海藻糖合成途徑獲得突變株JC41[20]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶-生物傳感分析儀法檢測海藻糖含量

酶解反應(yīng)體系(0.4 mL)包含適度稀釋的待測樣品(0.2 mL)、12 u海藻糖酶酶液(0.1 mL)和pH 4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0.1 mL)；反應(yīng)在55 ℃及pH 4.0條件下進(jìn)行10 min。反應(yīng)完成后快速冷卻，取樣用生物傳感分析儀(SBA-40C型，山東省科學(xué)院生物研究所)測定葡萄糖含量。由葡萄糖換算海藻糖含量如公式(1)所示：

CT=0.95×(C2-C1)

(1)

式中：CT，酶解反應(yīng)體系中海藻糖含量，mg/mL；C1，酶解前葡萄糖含量，mg/mL；C2，酶解后葡萄糖含量，mg/mL；0.95，海藻糖與葡萄糖含量換算系數(shù)。

1.2.2 檢測方法的專一性

向1.0 mg/mL的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品中分別添加不同濃度的葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，用1.2.1中方法檢測海藻糖含量。

1.2.3 檢測范圍的確定

取不同濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，用1.2.1中方法檢測海藻糖，以樣品海藻糖含量為橫坐標(biāo)(X)、所測葡萄糖含量為縱坐標(biāo)(Y)繪制擬合曲線。

1.2.4 回收率的計(jì)算

取不同濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，用1.2.1中方法檢測海藻糖，用以下公式計(jì)算回收率：

(2)

式中：R，回收率，%；Cc，計(jì)算得出的海藻糖濃度，mg/mL；CK，已知的海藻糖濃度，mg/mL。

1.2.5 檢測方法的穩(wěn)定性

取不同濃度海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度做6個平行測定，計(jì)算6次檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.6 HPLC法檢測海藻糖

參照GB/T 23529—2009推薦的方法[21]，選擇Luna 5u NH2100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶水=70∶30(體積比)，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.7 大腸桿菌胞內(nèi)海藻糖含量測定

各菌株劃線接種于LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，8 000 r/min離心5 min收集菌體，接種50 mL M9液體培養(yǎng)基(含5 g/L葡萄糖)，至OD600為0.1。再于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，不添加壓力因素，或分別添加葡萄糖和乙醇至終濃度為80 g/L和10 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。同上離心收集菌體并洗滌，以去離子水重懸細(xì)胞，于-70 ℃冷凍過夜。取凍存細(xì)胞煮沸20 min，冷卻后12 000 r/min離心15 min，上清液即為細(xì)胞溶解產(chǎn)物。以本研究建立的方法檢測胞內(nèi)海藻糖含量。

2 結(jié)果

2.1 海藻糖檢測專一性

在1.0 mg/mL的海藻糖溶液中分別添加不同濃度的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，測定海藻糖的含量，結(jié)果匯總于表1。在其他外源糖存在的情況下，檢測海藻糖的回收率為99.12%～102.28%，5種外源添加糖分子對海藻糖的檢測結(jié)果均無影響?？梢?，本法的專一性能夠滿足海藻糖的特異性檢測要求。

表1 外源糖存在條件下海藻糖的回收率Table 1 Recovery rate of trehalose in the presence of other saccharides

2.2 海藻糖檢測范圍

生物傳感分析儀可檢測葡萄糖的最低濃度為0.01 mg/mL，對應(yīng)樣品中海藻糖的檢測限為0.019 mg/mL。用本方法檢測系列濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果表明，海藻糖濃度在0.1 mg/mL以上時(shí)，檢測RSD小于10 %，根據(jù)MILLER[22]建議原則，此方法檢測海藻糖的定量限為0.1 mg/mL。

以樣品海藻糖含量為橫坐標(biāo)，以檢測所得葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，繪制擬合曲線如圖1所示。在海藻糖濃度為0.1～150.0 mg/mL范圍內(nèi)，樣品海藻糖含量與檢測所得葡萄糖含量具有良好的線性關(guān)系。在此范圍內(nèi)，檢測回收率在98.80%～101.33%。

圖1 海藻糖含量與葡萄糖釋放量之間的線性關(guān)系Fig.1 Linearity between trehalose content and detected glucose content

本檢測方法使用12 u海藻糖酶，在最適條件下反應(yīng)10 min，理論可水解最高濃度約為200 mg/mL的海藻糖樣品。結(jié)果顯示樣品海藻糖濃度在150 mg/mL范圍內(nèi)，能夠被完全水解為葡萄糖，通過生物傳感分析儀實(shí)現(xiàn)定量檢測；樣品海藻糖濃度高于150 mg/mL時(shí)，在此檢測條件下海藻糖不能被完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖，無法實(shí)現(xiàn)海藻糖定量檢測。實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)樣品海藻糖濃度或檢測操作要求，調(diào)整海藻糖酶用量或反應(yīng)時(shí)間，以降低檢測成本，提高檢測效率。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低濃度(1.0 mg/mL)、中間濃度(10.0 mg/mL)及高濃度(100.0 mg/mL)3種海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，做平行檢測，結(jié)果匯總于表2。各濃度標(biāo)準(zhǔn)品6次平行檢測確定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。

表2 本研究方法檢測海藻糖的穩(wěn)定性Table 2 Stability analysis of currently established method for trehalose determination

2.4 本法與HPLC法的比較

采用本研究建立的方法，同時(shí)采用HPLC法對已知濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(5.0 mg/mL)進(jìn)行檢測，測定結(jié)果匯總于表3。

表3 兩種方法檢測海藻糖的差異性分析 單位：mg/mLTable 3 Analysis of differences between two trehalose determination methods

經(jīng)t檢驗(yàn)分析，在95%的置信區(qū)間下，二者無顯著差異(P>0.05)。HPLC法測定往往需要對樣本進(jìn)行前處理，在多糖混合情況下還需對流動相組成進(jìn)行合理優(yōu)化才能將結(jié)構(gòu)相似的糖類分開。本研究方法樣品前處理相對簡單，在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)極大地提高了檢測的時(shí)效性。

2.5 大腸桿菌胞內(nèi)海藻糖含量分析

利用本研究建立的方法，對海藻糖代謝途徑遺傳修飾后大腸桿菌胞內(nèi)海藻糖含量進(jìn)行了分析，結(jié)果匯總于表4。運(yùn)用本研究方法，可檢測到胞內(nèi)海藻糖含量為2.35～83.39 mg/g (細(xì)胞干重)。海藻糖分解途徑刪除的突變株JC31以及在海藻糖分解途徑刪除的基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)化海藻糖合成途徑的突變株JC41，在無滲透壓壓力或80 g/L葡萄糖下，突變株JC31和JC41的胞內(nèi)海藻糖合成與積累水平顯著提高；在體積分?jǐn)?shù)1%乙醇條件下，突變株JC31和JC41的胞內(nèi)海藻糖合成與積累水平也顯著提高，但提升幅度不如80 g/L葡萄糖下顯著[20]。

表4 E. coli B0013-1031H及其突變株在不同培養(yǎng)條件下的胞內(nèi)海藻糖含量 單位：mg/gTable 4 Intracellular trehalose content of E. coli B0013-1031H and its mutants under different stress conditions

3 討論

本文利用特異性海藻糖酶水解海藻糖生成葡萄糖，結(jié)合生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，成功建立起一種海藻糖的快速定量檢測方法。此方法對海藻糖的檢測限為0.019 mg/mL，定量限為0.1 mg/mL。在0.1～150.0 mg/mL范圍內(nèi)，海藻糖含量與所測葡萄糖含量具有良好線性關(guān)系，回收率范圍為98.80%～101.33%。本方法操作簡便快捷，對樣品預(yù)處理無特殊要求，具有高特異性、較好的回收率和重復(fù)性，檢測結(jié)果與HPLC法無顯著差異，可以替代HPLC法用于海藻糖含量的快捷定量分析。

現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，海藻糖是環(huán)境脅迫下生物體自我保護(hù)的重要相容性溶質(zhì)[23-24]，也是若干新鮮食物材料的基本組成和可能的重要營養(yǎng)物質(zhì)[2, 25]。通過本研究獲得的海藻糖快捷定量分析方法，可以輔助若干工業(yè)菌種的選育過程，也可以在相關(guān)食品原材料的海藻糖含量分析與檢測中發(fā)揮重要作用。