宓月光，王偉明，孫銀玲，王萍，曹陽，陳麗艷

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150036)

淡豆豉(semen sojae praepatum)由豆科植物大豆的成熟種子輔以青蒿、桑葉發(fā)酵而成，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效[1]。豆豉是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品[2]，具有多種藥理活性[3-7]。經(jīng)過發(fā)酵，大豆中的大分子蛋白質(zhì)可降解為游離氨基酸，其既是營養(yǎng)物質(zhì)，也是生成生物胺、類黑精等活性物質(zhì)的成分[8,9]，又是風(fēng)味的基礎(chǔ)[10]。二者多為自然發(fā)酵制得，不同環(huán)境生產(chǎn)的產(chǎn)品中游離氨基酸含量差異較大，能夠影響產(chǎn)品質(zhì)量[11-13]。2015年版《中國藥典》淡豆豉標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了氨基酸的檢查和鑒別項(xiàng)[1]，因此，考察淡豆豉和豆豉純種發(fā)酵過程游離氨基酸的含量變化，對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝和提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

氨基酸多為無色晶體且不帶有紫外或者熒光基團(tuán)，不易檢測(cè)，使用衍生試劑進(jìn)行柱前或柱后衍生，可間接測(cè)出氨基酸的含量[14-16]。AccQ·Tag法是以6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)為柱前衍生試劑測(cè)定氨基酸的方法，此方法衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定、分離度好，被廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域[17-19]。

目前，尚未見應(yīng)用AQC柱前衍生檢測(cè)淡豆豉、豆豉發(fā)酵過程中游離氨基酸的相關(guān)報(bào)道。本研究以傘枝梨頭霉純種發(fā)酵制備淡豆豉和豆豉，采用Accq·Tag柱前衍生-高效液相色譜法分析其動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程17種游離氨基酸的含量變化，為后續(xù)藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

17種氨基酸水解標(biāo)樣混合液：天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)。含氨基酸摩爾濃度為2.5 mmol/L(半胱氨酸摩爾濃度為2.5 mmol/L相當(dāng)于胱氨酸1.25 mmol/L)；AccQ·Fluor衍生劑：硼酸鹽緩沖液、衍生劑粉末和衍生劑稀釋液、AccQ·Tag Eluent A(三水乙酸鈉-磷酸鈉洗脫液)、乙腈(色譜純)。

青蒿和桑葉，河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；黑豆，北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司。經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院鑒定，桑葉和青蒿分別為?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉和菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分，黑豆為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟種子。

菌株來源：DDC-SP11 分離自市售淡豆豉飲片，經(jīng)鑒定為Absidiacorymbifera(Cohn)Saccardo&Trotter (傘枝梨頭霉)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Alliance 2489高效液相色譜儀，美國Waters公司；BSA224S型賽多利斯電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制與柱前衍生

AccQ·Fluor衍生劑的配制：將衍生劑稀釋液于55 ℃預(yù)熱，吸取1 mL注入裝有AccQ·Fluor衍生劑粉末的瓶中，混勻，于55 ℃加熱直至溶解。

柱前衍生17種氨基酸混合標(biāo)樣：將17種氨基酸混合水解標(biāo)樣稀釋至100 μmol/L，取20 μL加入60 μL硼酸鹽緩沖液至內(nèi)襯管中，混勻，再加入20 μL衍生劑，立即混勻，在室溫下放置1 min，于55 ℃加熱10 min，即得。

1.3.2 色譜條件

AccQ·Tag高效Nova-PakTMC18柱(3.9 mm×150 mm，4 μm)；流動(dòng)相A為V(Waters AccQ·Tag Eluent A)∶V(超純水)=1∶10配制的水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為超純水；流速1 mL/min。熒光檢測(cè)：Ex激發(fā)波長250 nm，Em發(fā)射波長395 nm；進(jìn)樣量2 μL；柱溫37 ℃；洗脫程序參照顧偉鋼等[15]方法略作修改，如表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

注：曲線6表示線性換向；曲線11表示瞬時(shí)換向。

1.3.3 淡豆豉和豆豉樣品的制備

參照2015年版《中國藥典》淡豆豉制備方法[1]，按照質(zhì)量比為1∶1∶10稱取青蒿、桑葉和黑豆，青蒿、桑葉加入10倍體積的水煎煮2次，每次1 h，合并濾液，濃縮至與黑豆液固比為0.8 mL∶1 g。工藝流程：黑豆→清洗浸泡(淡豆豉用青蒿和桑葉水提液浸泡，豆豉用水浸泡)→分裝→滅菌→接種(DDC-SP11菌液，106個(gè)孢子/mL，接種量為2%)→培養(yǎng)(28 ℃)→發(fā)酵樣品→干燥(60 ℃)→測(cè)定水分(水分含量≤10%)→淡豆豉或豆豉。

分別于0、6、12、24、48、72、120、168 h收集各發(fā)酵階段樣品，60 ℃干燥，粉碎過三號(hào)篩，備用。

1.3.4 樣品游離氨基酸的提取及測(cè)定

參考李萍萍等[20]的方法，略作改動(dòng)。分別精密稱取各樣品200 mg，加入0.1 mol/mL的鹽酸10 mL，混勻，超聲40 min，8 000 r/min離心，取1 mL上清液用0.45 μm濾膜過濾，用1.3.1的方法做衍生處理，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品混合液和樣品的HPLC-FLD色譜圖

圖1為Accq·Tag法衍生的氨基酸混合標(biāo)樣的熒光色譜圖，除半胱氨酸(峰11)外，其他16種氨基酸都有較高的響應(yīng)值。圖2、圖3分別為不同發(fā)酵期淡豆豉、豆豉氨基酸衍生后的色譜圖，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，精氨酸(峰7)的峰面積逐漸減小，脯氨酸(峰10)的峰面積逐漸增大。

1-Asp;2-Ser;3-Glu;4-Gly;5-His;6-NH3;7-Arg;8-Thr;9-Ala;10-Pro;11-Cys;12-Tyr;13-Val;14-Met;15-Lys;16-Ile;17-Leu;18-Phe。下同。圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-FLD色譜圖Fig.1 HPLC-FLD chromatogram of amino acid mixed standards

圖2 不同發(fā)酵期淡豆豉的HPLC-FLD色譜圖Fig.2 HPLC-FLD chromatogram of semen sojae praepar-atum at different fermentation stages

圖3 不同發(fā)酵期豆豉的HPLC-FLD色譜圖Fig.3 HPLC-FLD chromatogram of fermented black beans at different fermentation stages

2.2 線性關(guān)系

將17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品混合液用衍生劑稀釋液稀釋成100、75、50、25、12.5、10、5 μmol/L的溶液，按照1.3.1的方法柱前衍生處理，依次進(jìn)樣。以氨基酸的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸方程，結(jié)果見表2。17種氨基酸在5～100 μmol/L的濃度范圍時(shí)，各氨基酸的峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，R2在0.994 1～0.998 0。

表2 17種氨基酸的線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of 17 kinds of amino acids

2.3 精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率

衍生后的17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液，以1.3.2項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD均為1.01%～2.63%，精密度良好；制備衍生后的樣品溶液，在室溫下放置0、3、7、12、18、24 h后分別進(jìn)樣測(cè)定，RSD為1.29%～2.48%，樣品中17種氨基酸的衍生物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密稱取30 mg的黑豆樣品6份，按照1.3.4方法，分別吸取10 μL樣品溶液，加入10 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生化后測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3，加標(biāo)回收率為91.29%～109.02%，RSD為0.2%～1.3%。

2.4 淡豆豉和豆豉動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程游離氨基酸的含量變化

結(jié)果如表4、表5所示，以水浸泡黑豆(0 h,未接菌)精氨酸含量為4.32 mg/g，脯氨酸為1.18 mg/g，絲氨酸為0.93 mg/g，其它氨基酸含量在0～0.4 mg/g(其中胱氨酸在所有樣品中均未出現(xiàn)色譜峰)，黑豆采用青蒿、桑葉水提液浸泡，各氨基酸含量變化不大。淡豆豉在發(fā)酵168 h時(shí)精氨酸含量由3.885 mg/g降低至0.209 mg/g，而脯氨酸含量則增長3.7倍，組氨酸、谷氨酸和甘氨酸含量均提高了2～5倍，絲氨酸含量則由0.836 mg/g降低至0.337 mg/g，其余的氨基酸未發(fā)生明顯變化。豆豉和淡豆豉發(fā)酵過程中17種游離氨基酸含量變化趨勢(shì)一致，且豆豉各發(fā)酵期的17種游離氨基酸含量略高于淡豆豉，可能是由于淡豆豉所用輔料青蒿、桑葉具有抑菌作用[21-22]，使該菌對(duì)蛋白質(zhì)的降解能力減弱，從而游離氨基酸的含量相對(duì)較低。

表3 黑豆中17種氨基酸的加標(biāo)回收率(n=3)Table 3 Scaling recovery of 17 amino acids in black beans (n=3)

發(fā)酵72 h之前氨基酸變化明顯，然后趨于平穩(wěn)，可能與發(fā)酵菌的生長代謝規(guī)律相關(guān)。微生物生長一般分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰老期，對(duì)數(shù)生長期微生物蛋白酶、水解酶等活性較高，蛋白質(zhì)迅速水解促使一些游離氨基酸含量不斷上升，到達(dá)平穩(wěn)期后，微生物蛋白酶活力減弱，游離氨基酸的生成速率降低；一些氨基酸在發(fā)酵過程中經(jīng)脫羧酶催化脫羧生成生物胺或發(fā)生美拉德反應(yīng)生成類黑精，也會(huì)使發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量降低[8-9]。

表4 淡豆豉動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程17種游離氨基酸的含量 單位：mg/gTable 4 The content of 17 kinds of free amino acids of semen sojae praeparatum during the dynamic fermentation

注：*ND表示在此條件下未檢測(cè)到，下同。

表5 豆豉動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程17種游離氨基酸的含量 單位：mg/gTable 5 The content of 17 kinds of free amino acids of fermented black beans during the dynamic fermentation

3 結(jié)論

本研究考察了傘枝梨頭霉發(fā)酵制備淡豆豉和豆豉游離氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，精氨酸和絲氨酸含量呈下降趨勢(shì)，脯氨酸、組氨酸、谷氨酸和甘氨酸的含量呈上升趨勢(shì)，其余氨基酸變化不明顯。本研究僅以傘枝梨頭霉作為發(fā)酵菌種進(jìn)行考察，而不同菌種產(chǎn)生酶的種類及活性不同對(duì)大豆蛋白的降解能力也存在差異，利用其它菌種發(fā)酵制備淡豆豉和豆豉游離氨基酸的變化有待進(jìn)一步研究。