唐柯，倪高玉，李記明，姜文廣，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東 煙臺(tái)，264000)

顏色是影響紅葡萄酒感官質(zhì)量的重要指標(biāo)[1]。其中花色苷是紅葡萄酒顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)葡萄酒顏色起著重要作用[2-3]。如何提高紅葡萄酒的色度和增強(qiáng)葡萄酒的穩(wěn)定性一直是葡萄酒釀造行業(yè)倍加關(guān)注的問(wèn)題。

花色苷主要以游離、結(jié)合和聚合形態(tài)存在于葡萄酒中，其中新鮮葡萄酒中主要是游離態(tài)的單體花色苷[3-4]。單體花色苷可以與輔色素分子間相互作用生成穩(wěn)定的復(fù)合物，進(jìn)而增強(qiáng)葡萄酒色澤、提高顏色穩(wěn)定性[5-6]。輔色素包括黃酮、其他酚類(lèi)、生物堿、有機(jī)酸等[5,7-8]。葡萄酒中存在大量的酚酸、黃烷醇、黃酮醇等酚類(lèi)物質(zhì)，其中一些單體酚是很好的輔色素，不同品種的葡萄釀造的酒中單體酚及單體花色苷種類(lèi)和含量都不同，所以在葡萄酒發(fā)酵前添加不同結(jié)構(gòu)輔色素(如酚酸、黃烷醇、黃酮醇等)或者利用不同葡萄品種共發(fā)酵，可以有效增強(qiáng)紅葡萄酒顏色及其穩(wěn)定性[9-11]。

近年來(lái)輔色素對(duì)葡萄酒顏色穩(wěn)定性影響的研究已陸續(xù)開(kāi)展，REIN在花色苷模擬溶液中分別添加槲皮素、蘆丁、綠原酸、5-磺酸槲皮素、5-磺酸莫蘭鈉鹽/單寧酸、中藥黃酮提取物7種輔色素，測(cè)定儲(chǔ)存過(guò)程中的紅移和增色效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮提取物的輔色效果最佳[12]。GMEZ-MGUEZ等通過(guò)輔色作用比較了槲皮苷、楊梅苷、咖啡酸、香豆酸、兒茶素、表兒茶素和原花青素B2這7種輔色素與花色苷malvidin-3-glucoside間輔色效果，研究了模擬酒體系在儲(chǔ)存過(guò)程中的顏色變化，結(jié)果顯示黃酮醇中楊梅苷和槲皮苷的輔色效果最好，酚酸中的咖啡酸及香豆酸次之，而兒茶素和表兒茶素的輔色效果最差[6]。SCHWARZ等研究了發(fā)酵前添加輔色素對(duì)赤霞珠及丹魄紅葡萄酒色澤的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加輔色素顯著增強(qiáng)了花色苷的提取以及輔色作用，提高了紅色色調(diào)，而上述作用在赤霞珠葡萄酒中表現(xiàn)的更為明顯，特別是添加了蘆丁或?qū)ο愣顾醄13]。DARIAS-MARTIN等向發(fā)酵前的Listan negro葡萄酒中添加兒茶素和咖啡酸作為輔色素，結(jié)果顯示,兒茶素增強(qiáng)了葡萄酒10%的顏色，而相同濃度的咖啡酸則增強(qiáng)了60%[14]。但是目前關(guān)于輔色素對(duì)葡萄酒花色苷及顏色影響的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道[15]。

本研究選擇3種不同類(lèi)型的輔色素(表焙兒茶素-黃烷醇、咖啡酸-酚酸、槲皮素-黃酮醇)，利用高效液相色譜對(duì)儲(chǔ)存過(guò)程中葡萄酒內(nèi)主要單體花色苷進(jìn)行檢測(cè)分析，采用CIELAB顏色參數(shù)系統(tǒng)比較不同輔色素對(duì)葡萄酒顏色及其穩(wěn)定性的影響，研究對(duì)葡萄酒釀造生產(chǎn)中進(jìn)一步提高紅葡萄酒的色澤及穩(wěn)定性具有很好的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單體花色苷：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside, Mv3g)、二甲花翠素乙酰葡萄糖苷(malvidin-3-O-acetylglucoside, Mv3ac) 、二甲花翠素香豆酰葡萄糖苷(malvidin-3-O-coumarylglucoside，Mv3cm)，純度分別為96.8%，96.3%，98.7%，實(shí)驗(yàn)室制備[12]；蛇龍珠葡萄，張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰咎峁?；槲皮?quercetin)、咖啡酸(caffeic acid)、表焙兒茶素(epigallocatechin，EGC)均為色譜純，購(gòu)自Sigma；乙腈、甲酸(色譜純)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計(jì)，上海翱藝公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；純水儀，美國(guó)Millipore公司；AL204-IC分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；P680戴安高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒釀造

參考TANG等的方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[16]，挑選完整無(wú)破損，無(wú)霉?fàn)€果的蛇龍珠，適度破碎。添加60 mg/L SO2、發(fā)酵助劑、酵母K1，參考文獻(xiàn)添加量添加輔色素EGC、咖啡酸、槲皮素120 mg/L[13]，28 ℃控溫發(fā)酵，空白組為未添加輔色素。每天循環(huán)2次，待液面平靜，皮渣沉底，主發(fā)酵基本結(jié)束。接著皮渣分離，酒泥經(jīng)低溫自然沉降后，上清酒液移至酒瓶，調(diào)硫至50 mg/L，滿(mǎn)容儲(chǔ)存。

1.3.2 花色苷的HPLC分析

利用實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[17]，選用LiChroCART C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)，520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫 45℃，進(jìn)樣體積 20 μL，流速 0.8 mL/min；

流動(dòng)相A∶V(水)∶V(乙腈)∶V(甲酸)=800∶100∶25，流動(dòng)相B∶V(水)∶V(乙腈)∶V(甲酸)=400∶500∶25(體積比)。

洗脫梯度：0～15 min，94%～70% A；15～30 min，30%～50% A；30～35 min，50%～60% A；35～

40 min，60%～6% A；40～45 min，6%A。

稱(chēng)取一定質(zhì)量的花色苷Mv3g、Mv3ac、Mv3cm，用V(水)∶V(乙晴)∶V(甲酸)=87∶3∶10混合溶液稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示。

表1 花色苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curves of three anthaocyanins

1.3.3 葡萄酒CIELAB顏色分析

葡萄酒樣品經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔水相濾膜過(guò)濾，經(jīng)0.5 cm光程，以蒸餾水作為對(duì)照，分別在 440、530和 600 nm下測(cè)定吸光度值，利用CIELAB法計(jì)算亮度L*、紅色色調(diào)a*、黃色色調(diào)b*、色度C*以及色調(diào)h參數(shù)，所有測(cè)定重復(fù)3次。

其中，L*代表亮度，L*=0代表黑色，L*=100代表無(wú)色，與葡萄酒顏色的深淺相關(guān)；a*代表紅/綠色參數(shù)，若a*>0，與紅色相關(guān)，a*<0，與綠色相關(guān)；b*代表黃/藍(lán)色參數(shù)，當(dāng)b*>0，與黃色相關(guān)，b*<0，與藍(lán)色相關(guān)；色度C*與葡萄酒的顏色鮮艷程度成正比；色調(diào)h表示不同的顏色[18]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理由SPSS 20.0(SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)及Microsoft Excel 2013實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔色素對(duì)葡萄酒顏色的影響

由表2可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，L*值會(huì)逐漸升高，葡萄酒顏色變淺。添加輔色素的葡萄酒亮度降低速度比對(duì)照組緩慢，空白組亮度損失最大，約為18%，添加EGC、咖啡酸和槲皮素的葡萄酒亮度損失率分別為13.5%、12.7%、8.1%。

表2 添加不同輔色素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中L*的變化Table 2 Changes in lightness (L*) of wine containing different copigments during storage

由表3可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，a*值逐漸降低，紅色色調(diào)降低，添加輔色素的葡萄酒紅色色調(diào)降低速度比對(duì)照組緩慢，空白組紅色色調(diào)降低最多，約為40.1%，添加EGC、咖啡酸和槲皮素的葡萄酒損失率分別為34.9%、31.1%、27.5%。 此外，添加EGC葡萄酒在儲(chǔ)存初期就具有較強(qiáng)的紅色色調(diào)，但儲(chǔ)存后期a*值下降較快。推測(cè)EGC與花色苷在開(kāi)始就形成輔色作用、生成輔色復(fù)合物，但輔色復(fù)合物的穩(wěn)定性較差[19]。

表3 添加不同輔色素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中a*的變化Table 3 Changes in redness of wine containing different copigments during storage

由表4可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，b*值略有升高，黃色色調(diào)升高。但不同處理對(duì)葡萄酒的b*值影響不同，空白組、添加EGC、咖啡酸和槲皮素的葡萄酒黃色色調(diào)增加率分別為17.3%、15.6%、12.9%、7.8%，空白組黃色色調(diào)要明顯高于添加輔色素的處理組。

表4 添加輔色素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中b*的變化Table 4 Changes in yellowness of wine containing different copigments during storage

由表5可以看出，儲(chǔ)存過(guò)程中3種添加輔色素葡萄酒的色度C*與紅色色調(diào)a*的變化趨勢(shì)相同。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒C*值逐漸降低，色度降低。添加輔色素的葡萄酒色度降低速度比對(duì)照組緩慢，空白組色度降低最多，約為34.67 %，添加EGC、咖啡酸和槲皮素的葡萄酒損失率分別為21.95 %、14.69 %、11.21 %。

表5 添加不同輔色素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中色度C*的變化Table 5 Changes in chroma of wine containing different copigments during storage

色調(diào)h值從-90到0，表示葡萄酒顏色從藍(lán)色到紅色漸變；從0到90，表示顏色從紅色到黃色漸變。這兩種變化是紅葡萄酒顏色隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)的變化方向.由表6可知，h值大于0且基本保持穩(wěn)定，但有緩慢增加的趨勢(shì)，說(shuō)明葡萄酒顏色由玫紅色向淺紅黃色轉(zhuǎn)移。GMEZ-MGUEZ等[20]、SUN等[21]也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，他們推測(cè)與形成了新色素的吡喃花色苷結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表6 添加不同輔色素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中色調(diào)h的變化Table 6 Changes in hue of wine containing different copigments during storage

2.2 輔色素對(duì)葡萄酒單體花色苷的影響

空白組葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷的變化如圖1所示。

本研究選擇Mv3g、Mv3ac、Mv3cm三種新鮮葡萄酒中最主要單體花色苷進(jìn)行分析。劉婷婷曾測(cè)定了赤霞珠、蛇龍珠和梅鹿輒3個(gè)品種的41款新鮮葡萄酒，發(fā)現(xiàn)花色苷Mv3g的含量最高，占單體花色苷含量的27.71%～60.62%；2種?；ㄉ誐v3ac和Mv3cm含量次之；此3種花色苷的含量占單體花色苷總含量的76.45%～98.11%[19]。由圖1可知，空白組總單體花色苷含量隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，新釀葡萄酒總單體花色苷含量179.51 mg/L，6個(gè)月后總單體花色苷含量76.27 mg/L，降低57.5%。

圖1 空白組葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷含量變化Fig.1 The content of monomeric anthocyanins duringwine storage in blank group

添加EGC葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷的變化如圖2所示。

與空白組相似，添加EGC葡萄酒總單體花色苷含量同樣隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，但是花色苷相較空白組減少更多，新釀葡萄酒總單體花色苷含量192.97 mg/L，6個(gè)月后總單體花色苷含量58.31 mg/L，降低69.7%。

圖2 添加EGC葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷含量變化Fig.2 The content of monomeric anthocyanins during wine storage in EGC group

添加咖啡酸的葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷的變化如圖3所示。

添加咖啡酸的葡萄酒中總單體花色苷含量隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，新釀葡萄酒總單體花色苷含量196.90 mg/L，6個(gè)月后總單體花色苷含量57.25 mg/L，降低70.9%.

圖3 添加咖啡酸葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷含量變化Fig.3 The content of monomeric anthocyanins during wine storage in caffeic acid group

添加槲皮素的葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷的變化如圖3所示。

與添加EGC和咖啡酸的葡萄酒相似，添加槲皮素的葡萄酒總單體花色苷含量同樣隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低(圖4)，新釀葡萄酒總單體花色苷含量196.87 mg/L，6個(gè)月后總單體花色苷含量53.46 mg/L，降低了72.8%。

圖4 添加槲皮素葡萄酒儲(chǔ)存過(guò)程中單體花色苷含量變化Fig.4 The content of monomeric anthocyanins during wine storage in quercetin group

輔助成色作用是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程，花色苷與輔色素形成穩(wěn)定的花色苷-輔色素復(fù)合物。從上述結(jié)果看出，添加輔色素后單體花色苷含量會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少的更快，但是色度C*與紅色色調(diào)a*的降解率卻遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組，推測(cè)是形成了穩(wěn)定的花色苷-輔色素復(fù)合物，在葡萄酒陳釀過(guò)程中可以使葡萄酒顏色衰減變緩，色澤更加穩(wěn)定[7]。

此外，總結(jié)關(guān)于花色苷輔色作用的文獻(xiàn)可知，在研究較多的幾類(lèi)輔色素中，提高花色苷穩(wěn)定性的能力由強(qiáng)到弱依次為黃酮醇>酚酸>黃烷醇[22-23]，本研究結(jié)果也與之相符，推測(cè)這與輔色素的立體結(jié)構(gòu)及分子大小有關(guān)[24-25]。

3 結(jié)論

通過(guò)分析儲(chǔ)存過(guò)程中4組葡萄酒CIELAB顏色參數(shù)及單體花色苷含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的輔色素對(duì)葡萄酒顏色影響不同。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，色度降低率依次為空白組>EGC>咖啡酸>槲皮素，紅色色調(diào)與色度變化趨勢(shì)一致；由于儲(chǔ)存過(guò)程中一方面單體花色苷會(huì)降解，另一方面輔色素也會(huì)與單體花色苷形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物，故葡萄酒的總單體花色苷含量會(huì)逐漸降低,而添加輔色素在一定程度上可以促進(jìn)這種輔助成色作用，對(duì)比添加EGC、咖啡酸和槲皮素組可知，總單體花色苷降低率依次為槲皮素>咖啡酸>EGC>空白組。綜合來(lái)看，3種輔色素對(duì)葡萄酒顏色穩(wěn)定性作用效果最好的是槲皮素，其次是咖啡酸、EGC。