劉旭瑩 孫思予 劉冬妍 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院消化內(nèi)科和實(shí)驗(yàn)研究中心,遼寧省環(huán)境與代謝疾病動(dòng)物模型研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004)

炎癥發(fā)生時(shí)免疫細(xì)胞會(huì)動(dòng)員到感染或傷口部位，是人體對病原體、過敏原和有毒化學(xué)刺激傷害感染身體時(shí)的直接保護(hù)性反應(yīng)，在這一過程中，白細(xì)胞介素17(IL-17)的作用不容忽視。IL-17是個(gè)大家族，由6個(gè)相關(guān)分子組成：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也稱為IL-25)和IL-17F，其中IL-17D了解很少。

1 IL-17家族成員

目前已確定在IL-17家族成員中，IL-17F與IL-17A的同源性最高(40%～55%)，其次是IL-17B(29%)、IL-17D(25%)、IL-17C (23%)和IL-17E(17%)[1,2]。不同的成員氨基酸序列不全相同，表明它們分別具有不同的作用。由于IL-17A最先在嚙齒動(dòng)物cDNA的轉(zhuǎn)錄物中被鑒定出來[3]，對于它的功能研究較為詳細(xì)。IL-17A主要由活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，它參與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集以及許多其他細(xì)胞因子的釋放，還與許多炎癥和自身免疫性疾病有關(guān)，包括關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、銀屑病、哮喘和囊性纖維化等[4]。IL-17F與IL-17A的同源性最高，因此它們具有很多相同的生理學(xué)功能，但由于存在氨基酸序列的不同，它們也執(zhí)行不同的功能：IL-17A參與自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤的發(fā)展，并在宿主防御細(xì)菌和真菌感染方面發(fā)揮重要作用，而IL-17F主要參與黏膜宿主防御機(jī)制[5]；IL-17B可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞系中TNF及IL-1β的表達(dá)并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤，表明它具有影響腫瘤進(jìn)展的潛力；IL-17E，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞的募集，以提供針對蠕蟲感染的保護(hù)并調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)[6,7]；IL-17C是孤兒受體IL-17RE的配體，研究表明，IL-17C-IL-17RE途徑對于預(yù)防腸道病原體感染以及包括銀屑病、炎癥性腸病和多發(fā)性硬化癥在內(nèi)的幾種自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[8-11]。盡管IL-17D具有與IL-17A和IL-17F相似的誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的能力，但它在免疫系統(tǒng)中的作用仍然很大程度上是未知的[5]。與其他IL-17家族成員不同，IL-17D優(yōu)先在骨骼肌、大腦、脂肪組織、心臟、肺和胰腺中表達(dá)，在免疫細(xì)胞中，IL-17D僅在靜息CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞中表達(dá)，因此可能在局部免疫反應(yīng)中發(fā)揮更大的作用[12]。IL-17D擁有202個(gè)氨基酸，是IL-17家族中最大的成員，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)IL-17D有4個(gè)半胱氨酸殘基參與二硫鍵的形成。它可能作為一個(gè)由兩個(gè)單體通過二硫鍵聚合而成的二聚體存在。IL-17D可以通過刺激IL-6、IL-8、GM-CSF等一系列免疫系統(tǒng)相關(guān)的細(xì)胞因子間接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并放大免疫效應(yīng)，從而在損傷組織的生長與修復(fù)，防御寄生蟲感染以及抑制造血功能等方面發(fā)揮重要作用。此外，IL-17D可能通過影響固有免疫系統(tǒng)中不同亞型的免疫細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的募集起到抑制腫瘤生長的作用。

2 IL-17D在脊椎動(dòng)物中的表達(dá)情況

在人類和高等脊椎動(dòng)物中已經(jīng)對IL-17進(jìn)行了大量研究，在哺乳動(dòng)物中，迄今已分離出六種IL-17家族基因(IL-17A-F),其中IL-17A和IL-17F已被廣泛研究。而在雞等禽類動(dòng)物及包括魚類在內(nèi)的低等脊椎動(dòng)物中進(jìn)行的關(guān)于IL-17D的研究工作都很少[13]。

2.1雞 從大腸桿菌感染的2周齡肉雞的睪丸、法氏囊、脾、胸腺、肺、空腸和肌肉組織中制備總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后預(yù)測雞IL-17D的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)雞IL-17D與人IL-17D具有64%氨基酸序列同一性，與小鼠IL-17D具有53%氨基酸序列同一性。研究人員發(fā)現(xiàn)巨型艾美耳球蟲(家禽常見腸道寄生蟲，Eimeria maxima)感染后，雞IL-17D的轉(zhuǎn)錄水平在腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、法氏囊、肺和脾中增加；同時(shí)用IL-17D重組蛋白處理雞成纖維細(xì)胞后IL-6、IL-8的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)。雞IL-17D刺激促炎細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的作用表明它可能是啟動(dòng)、維持以及控制禽類炎癥反應(yīng)的重要可溶性介質(zhì)，并且在被用作為疫苗佐劑時(shí)可能成為提高保護(hù)性免疫力的靶標(biāo)[14]。

2.2鴨 研究人員從健康的鴨大腸中提取總RNA合成cDNA后克隆編碼出哺乳動(dòng)物IL-17D的鴨同源物的全長cDNA，對比分析證明鴨IL-17D與雞IL-17D的cDNA序列具有約94.7%的同一性，與哺乳動(dòng)物的同源物具有62.6%～68.4%的同一性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)鴨IL-17D轉(zhuǎn)錄物在健康的淋巴組織如脾、胸腺和法氏囊中以相對較低的水平表達(dá)，這與雞IL-17D的表達(dá)分布類似。為了明確鴨IL-17D的功能，研究人員用疫里默氏菌(鴨類常見病原菌，Riemerella anatipestifer)肌內(nèi)感染鴨后發(fā)現(xiàn)與未感染的鴨相比，感染鴨肝臟和脾臟中的IL-17D mRNA的水平不變或顯著下調(diào)以此促進(jìn)病原性細(xì)菌感染期的有效宿主免疫。對于IL-17D在各種病原體感染時(shí)的表達(dá)差異及其針對這些病原體的具體防御機(jī)制還需要進(jìn)一步調(diào)查與評估[15]。

2.3斑馬魚 2006年研究人員在無菌條件下取出斑馬魚(zebrafish)的腸、鰓、脾、腎并分離組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR,發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)存在IL-17基因。通過對分離的IL-17基因進(jìn)行分類，斑馬魚IL-17D與人IL-17D具有52.8%的氨基酸同一性，當(dāng)比較斑馬魚與其他IL-17基因的核苷酸序列時(shí)，IL-17D的核苷酸同一性也被認(rèn)為是最高的(57.5%)，進(jìn)一步證明斑馬魚IL-17D是人IL-17D的同源物。為了明確斑馬魚中IL-17D基因表達(dá)的定位，通過實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)從正常組織和脂多糖(LPS)刺激的(體外)組織(腸、鰓、脾和腎)分析IL-17D基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩種情況下均有IL-17D的表達(dá)，說明IL-17D也可能在正常情況下發(fā)揮重要作用[16]。

2.4硬骨魚 采用TRIZOL方法從大西洋鮭魚(Atlantic salmon)中提取來自肝臟、脾臟、頭腎、鰓、胸腺、腸，心臟，皮膚，腦，卵巢和睪丸組織的總RNA。通過RT-PCR檢測不同組織中IL-17D的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-17D廣泛分布于所檢查的組織中。其中睪丸、卵巢和皮膚中的水平較高，肝臟中的表達(dá)水平非常低，這表明各種細(xì)胞參與了大西洋鮭魚IL-17D的產(chǎn)生。盡管IL-17D在主要淋巴器官如頭腎(魚類淋巴組織)和脾相對于皮膚、腸和性腺中表達(dá)水平較低，但在腹膜內(nèi)注射活嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、LPS和β-葡聚糖后，頭腎和脾中IL-17D的時(shí)間依賴性表達(dá)證實(shí)了IL-17D可能參與魚類抗菌免疫防御[17]。

隨后，利用人類、斑馬魚和日本河豚(Japanese pufferfish Takifugu rubripes)基因組之間的同線性守恒來鑒定日本河豚IL-17家族基因序列，分析發(fā)現(xiàn)河豚IL-17D與人和斑馬魚IL-17D分別具有49%和54.4%的氨基酸同一性。在各種IL-17家族基因中，河豚IL-17D的氨基酸相似性在斑馬魚IL-17D(67.9%)和人IL-17D(64.9%)中最高。之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在斑馬魚和鮭魚中，LPS刺激均導(dǎo)致IL-17D的表達(dá)上調(diào)[16,17]。于是在該研究中還檢查了魚中免疫相關(guān)組織IL-17家族基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所有IL-17D基因在LPS刺激的頭腎組織中顯示高水平的表達(dá)，說明IL-17D與炎癥活動(dòng)有關(guān)[18]。

我們知道RAR相關(guān)孤兒受體(RAR-related orphan receptors，RORs)是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的核受體家族成員，序列對比發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的RORα和RORγ與其他硬骨魚類物種和人類的同源物具有高度同一性。據(jù)報(bào)道哺乳動(dòng)物中RORα和RORγ共同協(xié)調(diào)IL-17A和IL-17F的表達(dá)[19]，但對于IL-17D的影響還不明確，為了探究二者在半滑舌鰨中對IL-17D的影響，研究人員通過共轉(zhuǎn)錄活性分析發(fā)現(xiàn)RORα和RORγ都增加了IL-17D的啟動(dòng)子活性[20]。這一結(jié)果說明半滑舌鰨的IL-17D可能受RORα和RORγ的調(diào)節(jié)進(jìn)而發(fā)揮在免疫系統(tǒng)中的作用，但具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。這一結(jié)果也為研究人 IL-17D表達(dá)的影響因子提供了一個(gè)新的研究方向。

最新的研究是圍繞大黃魚(large yellow croaker or Larimichthys crocea)進(jìn)行的。嗜水氣單胞菌注射后經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)IL-17D表達(dá)水平顯著上調(diào)，鰓中72 h達(dá)到峰值，頭腎和脾中6 h達(dá)到峰值，說明IL-17D在抗菌免疫中的潛在作用。同時(shí)，在檢查的所有組織中，IL-17D在鰓和皮膚中具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，鰓和皮膚是黏膜組織，這表明IL-17D可能參與抗病原性入侵的黏膜免疫[21]。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)草魚(grass carp or Ctenopharyngodon idella)IL-17D能夠促進(jìn)頭腎原代細(xì)胞IL-1β、TNF-α等基因表達(dá)[22]，并且證實(shí)大黃魚IL-17D也促進(jìn)上述因子的表達(dá)，進(jìn)一步支持了魚類IL-17D在宿主防御和促炎癥反應(yīng)等方面的免疫調(diào)節(jié)功能。

3 IL-17D與B-CLL

B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)是一類起源于造血組織的惡性腫瘤，使用純化的人IL-17D蛋白對正常人單核骨髓細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IL-17D對骨髓祖細(xì)胞具有抑制作用[12],這種抑制作用可能是由于IL-17D誘導(dǎo)抑制性細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生所致[23]。因此研究人員想要了解IL-17D在B-CLL中的作用，把B-CLL患者和健康者的細(xì)胞分離后分離蛋白質(zhì)，通過Western免疫印跡(Western blot)證實(shí)患者和健康人的B淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(PMNs)中都存在IL-17D。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)患者PMNs中IL-17D的表達(dá)顯著升高[24]。一方面，它的存在可以通過誘導(dǎo)IL-6、IL-8和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的產(chǎn)生以及內(nèi)皮細(xì)胞的活化來影響中性粒細(xì)胞的募集[12,24]。另一方面，它可以減少TNF-α和IL-12的產(chǎn)生以及中性粒細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。這種變化似乎指出了未來研究的重要方向,同時(shí)也給大家提供了一種思路，也許IL-17D在慢性貧血中起作用，其中長期免疫刺激和IL-17D產(chǎn)生增加導(dǎo)致造血功能降低?？赡芡ㄟ^誘導(dǎo)釋放其他細(xì)胞因子，造血的負(fù)調(diào)節(jié)因子直接或間接地在調(diào)節(jié)造血對炎癥的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。

4 IL-17D抑制腫瘤生長

腫瘤免疫編輯是適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)控制腫瘤生長和塑造腫瘤免疫原性的過程，包括清除、平衡和逃逸三個(gè)階段。在這一過程中，已經(jīng)證實(shí)來源于野生型(WT)小鼠的低免疫原性編輯過的腫瘤細(xì)胞系(稱為“進(jìn)展型”)可以產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞促進(jìn)因子，比如GM-CSF、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、TNF-α等[25,26]。而來自免疫缺陷小鼠的具有高度免疫原性未經(jīng)編輯的腫瘤細(xì)胞系(被稱為“回歸型”)在腫瘤免疫編輯過程中的作用還沒有明確的解釋。我們可以認(rèn)為未經(jīng)編輯的腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的腫瘤表達(dá)因子可以激活宿主腫瘤免疫監(jiān)視。IL-17D是一種腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子，它可以通過誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子(CC)2(CCL2或者稱MCP-1)募集自然殺傷(NK)細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，從而促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞發(fā)育和抗腫瘤適應(yīng)性免疫應(yīng)答[27]。研究人員使用了一種模型系統(tǒng)，通過免疫缺陷型Rag2基因敲除(Rag2-/-)和免疫活性野生型小鼠，由3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene，3-MC)誘導(dǎo)纖維肉瘤，產(chǎn)生高度免疫原性的，未編輯的“回歸型”和免疫原性差的，編輯的“進(jìn)展型”腫瘤細(xì)胞系，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)與進(jìn)展型腫瘤細(xì)胞相比，IL-17D在回歸型細(xì)胞中表達(dá)和分泌的程度更高。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性人腫瘤樣本中IL-17D表達(dá)被抑制，表明IL-17D在某些人類癌癥中的表達(dá)消除了腫瘤進(jìn)展，并且IL-17D的高表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，在這一過程中，MCP-1和NK細(xì)胞對IL-17D的抗腫瘤作用是必需的。這一結(jié)論在肺臟腫瘤中得到了驗(yàn)證，即IL-17D上調(diào)肺腫瘤組織 NK 細(xì)胞含量抑制腫瘤克隆形成[28]。然而，由于IL-17D在編輯的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)排斥反應(yīng)，基于IL-17D的治療可能需要與其他免疫治療劑聯(lián)合使用，例如檢查點(diǎn)阻滯和(或)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制劑[29]。

5 IL-17D與其他因子的關(guān)系

核因子 E2 相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)是氧化應(yīng)激的主要應(yīng)答者[30]。人活化Th細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)Nrf2基因轉(zhuǎn)錄來增加Nrf2的表達(dá)及活性，同時(shí)，Nrf2的誘導(dǎo)增強(qiáng)了Th細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)但不影響它們表達(dá)炎癥因子的能力[31]。我們知道Nrf2可以保護(hù)體細(xì)胞和癌前細(xì)胞免受致癌物質(zhì)的影響，對腫瘤起抑制作用[32,33]。Nrf2和IL-17D均在原發(fā)性腫瘤中以及在體內(nèi)病毒感染期間被誘導(dǎo)，并且IL-17D在腫瘤和病毒感染的細(xì)胞中的表達(dá)對于宿主的最佳保護(hù)是必需的。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Nrf2直接與IL-17D啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。隨后通過檢查IL-17D、Nrf2在人和小鼠原代腫瘤中的表達(dá)變化，與正常組對比后發(fā)現(xiàn)，Nrf2-IL-17D軸在原代腫瘤發(fā)生期間被激活，也就是說Nrf2直接誘導(dǎo)IL-17D作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[34]。Seelige等[35]發(fā)現(xiàn)腹膜感染鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)的Nrf2-/-小鼠中IL-17D的上調(diào)完全被消除，表明Nrf2對于MCMV誘導(dǎo)的IL-17D是必需的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Nrf2-/-小鼠對MCMV感染的敏感程度高于IL-17D-/-小鼠，這提示Nrf2可能調(diào)節(jié)其他病毒感染的抗性介質(zhì)。由于IL-17D可以誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞C-C趨化因子受體2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)從而募集NK細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Nrf2-/-小鼠中CCL2的變化并不顯著，表明存在著其他機(jī)制控制病毒誘導(dǎo)的CCL2表達(dá)。Nrf2激活劑叔丁基對苯二酚(Tertiary butylhydroqui-none,tBHQ)在腫瘤中也可以局部誘導(dǎo)IL-17D[26]，但研究人員發(fā)現(xiàn)雖然注射tBHQ可以保護(hù)WT小鼠免受MCMV感染，但tBHQ同時(shí)也激活了獨(dú)立于Nrf2以外的其他保護(hù)途徑。類似的情況也出現(xiàn)在小鼠的CCL2中，注射tBHQ在Nrf2-/-和IL-17D-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)CCL2仍被誘導(dǎo)，說明tBHQ也激活了除Nrf2和IL-17D以外的途徑。因此關(guān)于Nrf2、IL-17D和這些因子在其他類型的感染以及其他類型腫瘤中的具體參與情況仍然需要研究確定。

6 展望

IL-17家族細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中具有多種功能，不僅可以誘導(dǎo)許多細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，而且在很多自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。其中IL-17D是最古老但也是研究相對較少的，隨著對IL-17D日趨深入與廣泛的研究，我們發(fā)現(xiàn)它在腫瘤和白血病等疾病中的作用至關(guān)重要。因此更好地了解IL-17D的表達(dá)水平、調(diào)節(jié)手段、作用方式及它與相關(guān)因子之間的關(guān)系不僅可以為免疫治療提供新方法，同時(shí)也為其他疾病的深入研究提供新思路。