謝 輝，林上陽，夏晨潔，吳 麗，陳志鵬，李偉東

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 2.江蘇省中藥炮制重點實驗室, 3.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

腸道具有人體最大的細菌群落，每個人都攜帶多達數(shù)百種的腸道細菌。微生物群給予宿主包括維生素的生產(chǎn)，從飲食中提取營養(yǎng)和能量，代謝功能，先天和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，以及對病原微生物的保護。微生物組的改變與人類的一些慢性疾病有關(guān)，包括炎癥性腸病、肥胖癥、代謝性疾病、營養(yǎng)不良、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥和心血管疾病[1]。

中國國家衛(wèi)生健康委員會2018年調(diào)查顯示，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為中國中老年人群的重要健康問題，中老年女性骨質(zhì)疏松問題尤為嚴重。50歲以上女性骨質(zhì)疏松癥患病率為32.1%,65歲以上女性的骨質(zhì)疏松癥患病率更是達到51.6%。在不經(jīng)意間影響著人類的健康，多見于疼痛、駝背。更嚴重的是，在日常運動中，家務(wù)過程中，即使沒有明顯較大的外力作用，不經(jīng)意間便可發(fā)生骨折，多發(fā)生于胸、腰椎椎體、橈骨遠端及股骨上端，阻礙人們的日常生活，降低人民生活幸福感。除此之外，骨質(zhì)疏松引發(fā)的胸、腰椎壓縮性骨折會降低呼吸功能，出現(xiàn)呼吸困難等情況。目前針對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療藥物主要包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、激素替代劑和降鈣素等，臨床實驗證實這些藥物均有較好的臨床療效。但部分藥物的潛在并發(fā)癥及副作用也隨之突顯[2]。而對于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松研究較少，所以亟需尋找到新的靶點，開辟一條安全有效的途徑，治療多種因素引起的骨質(zhì)疏松癥。

腸道微生態(tài)與骨代謝的相關(guān)性是近年來研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病相關(guān)[3]，腸道中的微生物可能通過自身代謝產(chǎn)物、影響宿主代謝、調(diào)節(jié)腸道屏障功能以及免疫系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化藥物代謝等途徑影響骨質(zhì)疏松。本文將通過由腸道菌群介導(dǎo)的諸多途徑闡述腸道菌群影響骨質(zhì)疏松的機制，并對靶向腸道治療骨質(zhì)疏松的藥物進行綜述。

1 腸道微生物影響骨質(zhì)疏松癥機制

1.1 腸道菌群自身代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸道菌群的代謝產(chǎn)物，由羧酸和小烴鏈組成。其中，乙酸、丙酸和丁酸的研究最多，其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為 2 、3 、 4 個碳。Lucas等[4]通過對小鼠喂SCFA丙酸酯 (C3) 和丁酸酯 (C4),使體內(nèi)的SCFAs含量增加，測得小鼠的骨含量顯著增加，由此可以表明 SCFAs 含量對于骨量的保護有一定的作用。而從機制上說，一方面，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，骨吸收標志物血清水平顯著降低，另一方面，體外實驗表明, C3 和 C4 顯著抑制了兩個必需的破骨細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分 TRAF6 和 NFATc1，這些實驗從不同角度有力的表明與骨吸收的抑制有關(guān)，SCFAs 對骨形成也有一定的影響。Tyagi 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽能夠增加調(diào)節(jié)性 T 細胞(Treg) 在腸道和骨髓中的數(shù)目，而 Treg 細胞能夠刺激CD8+T細胞分泌 Wnt 配體Wnt10b,從而通過激活成骨細胞中的 Wnt 信號刺激骨形成。間充質(zhì)干細胞(NSCs)具有成骨和成脂的能力， Chen 等[6]研究表明，MSCs當被誘導(dǎo)進行成骨分化時，丁酸鈉能夠刺激成骨分化并上調(diào) Runx2 和 Runx2 調(diào)節(jié)基因的表達，也能夠通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞分化。

除了通過直接干預(yù)破骨細胞分化及骨形成等，SCFAs還可以影響礦物質(zhì)的吸收。試驗結(jié)果表明，SCFAs可通過調(diào)節(jié)礦物質(zhì)離子與氫離子之間的電解質(zhì)交換，直接影響腸道對礦物質(zhì)的吸收，促進上皮細胞對礦物質(zhì)離子的吸收[7]。SCFAs 可以降低腸腔內(nèi)的pH值，增加鈣在大鼠結(jié)腸段的轉(zhuǎn)運，促進鈣的吸收。在牛中，丁酸可以激活中性粒細胞，誘導(dǎo)鈣離子(Ca2+)內(nèi)流和絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，丙酸鹽會增加中性粒細胞 Ca2+內(nèi)流[8]。綜上所述，腸道菌代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸能夠有效的干預(yù)骨質(zhì)疏松癥，為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療提供新手段。

1.2 宿主-微生物群共代謝腸道微生物群的組成和活動自出生起就與宿主共同發(fā)育，并受到宿主基因組、營養(yǎng)和生活方式之間復(fù)雜的相互作用影響。越來越多研究表明，腸道微生物群通過一系列相互作用的宿主-微生物群代謝、信號傳導(dǎo)和免疫炎性軸，參與調(diào)節(jié)多種哺乳動物體內(nèi)的代謝途徑，這些軸在生理學(xué)上連接腸道、肝臟、大腦和其他器官[9]。

Xing等[10]分析慢性深度缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細胞與腸道菌群的關(guān)系。成骨細胞由骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來，成骨細胞的成骨作用不能夠平衡破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收，導(dǎo)致骨量降低是骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制之一。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性深度缺氧導(dǎo)致腸道微生物群落多樣性發(fā)生改變，乳酸菌顯著減少，降解 D-半乳糖的酶減少，使D-半乳糖累積，而累積的D-半乳糖使血液和骨髓中能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞過早衰老的活性氧積累。

要研究腸道菌群和宿主之間的這一復(fù)雜的代謝體系，代謝組學(xué)是目前較為有效的研究手段。Xu 等[11]采用非靶向代謝組學(xué)策略，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等代謝途徑是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠代謝功能改變最多的途徑。大多數(shù)代謝途徑與糖代謝、分子轉(zhuǎn)運和脂質(zhì)有關(guān)。龍維富等[12]研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的血漿代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較,去卵巢組大鼠代謝產(chǎn)物乳酸、丙酮和乙醇水平升高,而膽堿/磷脂酰膽堿、丙氨酸、 VLDL/LDL 、 HDL/LDL 、血糖及脂肪酸水平降低。如核糖體，糖酵解，氨基酸生物合成，碳代謝，和氧化磷酸化，已被證明調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化，影響骨形成。鄭曉皎[13]通過對抗生素干擾實驗，利用 UPLC/QTOFMS 和 GC/TOFMS 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了腸道菌群-宿主代謝物組的全譜和靶標分析平臺。其中，色氨酸代謝途徑、酪氨酸、苯丙氨酸代謝途徑、腦-腸軸、短鏈脂肪酸和糖類物質(zhì)、中長鏈脂肪酸和膽酸類物質(zhì)等以及代謝的改善與腸道微生物群的改變密切相關(guān)[14]。綜上所述，骨質(zhì)疏松癥的治療與宿主代謝有著密不可分的關(guān)系，而腸道菌群又影響著一些宿主代謝，形成腸道菌-宿主共代謝。但是關(guān)于這方面的靶向性來影響骨質(zhì)疏松的機制研究的還不夠深入，還需要進一步深入研究，也為骨質(zhì)疏松的預(yù)防與治療提供了新思路，具有社會價值。

1.3 腸道屏障與免疫腸道屏障在維持宿主體內(nèi)平衡中起重要作用。腸上皮由連續(xù)的單層腸上皮細胞組成，其通過緊密連接(TJ)蛋白密封在一起。TJs是由Claudins蛋白、Occludin蛋白和Zo蛋白組成的一種蛋白質(zhì)復(fù)合物,決定了細胞外溶質(zhì)的滲透性。腸上皮被一層粘液覆蓋，由粘蛋白組成，形成物理屏障。該屏障阻止了微生物與上皮表面的相互作用，抑制細菌粘附到腸上皮細胞，限制免疫反應(yīng)和維持屏障功能。腸道微生物群的生態(tài)失調(diào)，使具有降解粘蛋白能力的細菌豐度增加，影響粘蛋白產(chǎn)生[15]。粘蛋白的減少，使細菌更多黏附到腸上皮細胞，使腸上皮細胞上的模式識別受體發(fā)出信號，激活 NF-κB 通路。上皮細胞 NF-κB 活化增加促炎細胞因子，如 TNF-α、IL-1和INF-γ等。幾種細胞因子可以調(diào)節(jié)TJ復(fù)合物，TJ連接其頂端側(cè)的相鄰上皮細胞，TJ蛋白復(fù)合物由連接粘附分子、occludins、橋粒、密蛋白和細胞骨架連接蛋白組成，提供粘合力以確保上皮層的完整性。TNF-α增加肌球蛋白輕鏈激酶的表達，IFN-γ降低ZO-1蛋白合成，增加TJ蛋白的內(nèi)化并重新排列肌動蛋白細胞骨架。使得上皮層完整性被破壞，腸道通透性增加[16]。腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道菌群中的有害菌以及產(chǎn)生的影響骨質(zhì)疏松的有害代謝物可以進入機體，進一步引發(fā)免疫應(yīng)答，并且生成大量以TNF-α為主的促破骨細胞生成因子,TNF-α誘導(dǎo)核因子κB受體活化因子配體和巨噬細胞集落刺激因子的生成，并下調(diào)骨保護素，最終促進破骨細胞的激活和骨吸收[17]。 Xiao等[18]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，無菌組與無特定病原體 (SPF) 組骨髓間充質(zhì)干細胞與 T 細胞共培養(yǎng)，并檢測它們誘導(dǎo) T 細胞凋亡的能力，發(fā)現(xiàn) SPF 組顯著誘導(dǎo)更多的 T 細胞凋亡。綜上所述，腸道菌群失調(diào)、腸道上皮屏障功能減弱和免疫系統(tǒng)反應(yīng)性增強，導(dǎo)致腸道致病菌有害代謝物可以通過腸道上皮屏障進入機體，進一步引發(fā)CD4+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，生成大量以TNF-α為主的促破骨細胞生成因子，最終促進破骨細胞的激活和骨吸收。

1.4 中藥和腸道菌群相互作用中藥具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護腸黏膜屏障的作用，而腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化中藥有效成分，使其更易被機體吸收，還有增強藥效、降低毒性的作用。傳統(tǒng)中藥吸收利用度不高，但療效好，因腸道菌群在其中的轉(zhuǎn)化作用。腸道菌群對中藥成分的生物轉(zhuǎn)化以水解作用為主，氧化還原作用為輔，在這些水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等代謝酶的作用下，中藥成分轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的藥理或毒理成分而發(fā)揮作用[19]。迄今已發(fā)現(xiàn)的植物雌激素有400多種, 其中腸道菌群對黃酮類、異黃酮類、木脂素類研究較多。

異黃酮類在腸道菌群的轉(zhuǎn)化下會代謝成雌馬酚，而雌馬酚具有更強雌激素樣作用，對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防有較好的療效。木脂素類化合物如松脂醇二葡萄糖苷以及牛蒡苷等需經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化為哺乳動物中的木脂素如腸二醇和腸內(nèi)脂后，才能呈現(xiàn)出一定的雌激素樣活性，動物木脂素在結(jié)構(gòu)上與雌二醇等內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似。因此，可與內(nèi)源性雌激素競爭性與雌激素受體(ER)結(jié)合，抑制或結(jié)合ER，進而產(chǎn)生雙相的雌激素或抗雌激素樣作用，用于治療骨質(zhì)疏松[20-21]。

2 靶向腸道制劑

2.1 益生元治療骨質(zhì)疏松根據(jù)定義，益生元纖維具有抗吸收性，并且通過下腸中的結(jié)腸微生物群水解和發(fā)酵。當以足夠的量摻入飲食中時，期望的結(jié)果是它們將選擇性地刺激對宿主具有有益作用的一些細菌的生長[22]。近年來，以腸道菌群為靶點治療骨質(zhì)疏松成為熱點，多種實驗表明補充益生元對骨質(zhì)疏松癥有治療作用。益生元在各種食物中發(fā)現(xiàn)的化合物中含有，例如菊苣，大蒜，韭菜，香蕉，洋蔥和麩皮中。二糖具有兩個糖單元，例如乳果糖或乳糖醇，它是最早與腸道微生物群體相關(guān)的益生元之一。低聚糖含有3～10個糖單位。包括短鏈低聚果糖、低聚半乳糖。較長鏈接的益生元>10單位包括菊粉和抗性淀粉。低聚果糖均增加雌激素缺乏的卵巢切除大鼠的鈣吸收，還可通過減少雄性衰老小鼠的全身炎癥，改善腸道微生物群，減少骨吸收[23]?？诜事毒厶菍Υ笫笱乐苎滓鸬难啦酃莵G失具有保護作用，在保護腸道的同時，可改變組織學(xué)和免疫炎性參數(shù)[24]。Tousen等[25]發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉通過改變腸道菌群的組成，從而下調(diào)去卵巢小鼠骨髓中核因子 kappa-B 配體受體激活因子和IL-7受體基因的表達，從而減輕卵巢切除引起的骨質(zhì)流失。

2.2 中藥治療骨質(zhì)疏松依據(jù)補充益生元能夠有效治療骨質(zhì)疏松癥，將腸道菌群作為藥物治療骨質(zhì)疏松的新靶點，對藥物產(chǎn)生藥效做出新闡釋。以納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆而得的納豆具有溶血栓、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥以及調(diào)節(jié)腸功能等許多作用，通過實驗表明納豆能夠顯著促進健康小鼠及抗生素誘導(dǎo)的腹瀉模型小鼠腸道中厭氧菌群的生長，抑制好氧菌群的增殖，有望成為一種益生元類物質(zhì)應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)中[26]。在慢性炎癥性腸病動物模型中適度提高大豆飲食，可以降低腸道炎癥分數(shù)和結(jié)腸基因表達的 TNF-α,有效地減輕腸道炎癥、淋巴結(jié)構(gòu)改變和有益地改變骨代謝。大豆素是一種在大豆中發(fā)現(xiàn)的主要異黃酮，可通過腸道菌群代謝為雌馬酚，該產(chǎn)物具有比大豆苷元更強的雌激素活性，對骨骼健康產(chǎn)生有利影響[27]。桑樹和蒲公英水提取物可以降低大腸內(nèi)厚壁菌門與擬桿菌門的比例，腸道菌群的變化改變了能量代謝和葡萄糖代謝，可以治療酒精性脂肪肝引起的骨質(zhì)流失[28]。Jia 等[29]研究小檗堿治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的牙周炎，發(fā)現(xiàn)小檗堿通過富集產(chǎn)丁酸屬菌群，提高腸道丁酸鹽濃度，治療后腸道屏障完整性得到改善，腸道通透性降低，牙槽骨 IL-17A+細胞減少，IL-17A相關(guān)免疫反應(yīng)減弱，明顯降低了去卵巢-牙周炎大鼠的牙槽骨丟失，改善了骨代謝。Zhao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，墨旱蓮能夠改變細菌群落從而顯著改善骨微結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和乳球菌的數(shù)量與墨旱蓮的劑量呈正相關(guān)。

3 展望

目前在臨床上用于治療和阻止骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的藥物分為兩大類，第一類為抑制骨吸收藥，包括鈣劑、維生素 D 及活性維生素 D 、降鈣素等；第二類為促進骨性成藥，包括氟化物、合成類固醇、甲狀旁腺激素等。讓人感到興奮的是，近年來有大量研究表明補充益生菌也可以防止骨質(zhì)疏松，并且益生菌用藥治療骨質(zhì)疏松也用于臨床治療，這是區(qū)別于傳統(tǒng)防治骨質(zhì)疏松的一大突破，對于靶向腸道制劑提供了一定的理論基礎(chǔ)。本文在此的基礎(chǔ)上，梳理了腸道菌群影響骨質(zhì)疏松的可能因素，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

腸道菌群的研究是目前的難點和熱點，中藥對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用逐步被認可，現(xiàn)在大部分的研究還是停留在單味藥，而在中醫(yī)基礎(chǔ)理論下，中藥經(jīng)過炮制配伍能夠更好地發(fā)揮藥效，而對于中藥復(fù)方的研究較少，是不足所在。中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松的療效得到認可，但中藥復(fù)方化學(xué)成分極其復(fù)雜，其對骨質(zhì)疏松的治療是多途徑和多靶點的，目前對中藥復(fù)方的多靶點還有待在分子水平和基因水平進行深入的研究，而腸道菌群作為新靶點，為中藥治療骨質(zhì)疏松提供了新的闡釋，也能夠從腸道新靶點探尋更多藥物預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松癥。而是否所有靶向腸道制劑的中藥都能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松呢？骨質(zhì)疏松究竟和哪些特殊的菌群或者菌落有密切關(guān)系，目前研究還較少，不能夠篩選出靶向腸道制劑治療骨質(zhì)疏松的最佳中藥復(fù)方。之后，我們需要針對如何將中藥復(fù)方中的某些最有效成分群與治療骨質(zhì)疏松最有效腸道菌聯(lián)系起來，制備出療效顯著的新劑型，明確中藥復(fù)方如何通過腸道菌群治療骨質(zhì)疏松進行深入研究。