張 誼，王立暉，王惠霞，朱紅濤，吳明海，周 婷，黃曉佳

(1.南通大學附屬丹陽醫(yī)院，江蘇 丹陽 212300；2. 常州大學生物醫(yī)學工程與健康科學研究院，江蘇 常州 213164)

隨著人口老齡化的加速，肝臟疾病的發(fā)生率和死亡率日趨上升。盡管有疫苗接種計劃和抗病毒藥物的使用，但由于長期不良的生活習慣和營養(yǎng)過剩，全球肝病問題進一步加重，已經(jīng)嚴重影響著人類的健康。因此，開發(fā)有效的肝病治療和預防藥物已迫在眉睫。丹參為唇形科植物鼠尾草屬丹參的干燥根和莖，丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)是其有效脂溶性成分之一，具有廣泛的藥理活性。但Tan ⅡA是小分子脂溶性物質(zhì)，口服吸收差，生物利用度低，臨床使用受限，因此，研究和開發(fā)新的Tan ⅡA劑型受到越來越多的關注。本文就近十年來對Tan ⅡA在肝臟疾病中的作用機制研究及劑型的發(fā)展進行綜述。

1 Tan ⅡA在肝臟疾病中的作用

1.1 Tan ⅡA在炎癥相關性肝損傷中的作用炎癥相關性肝損傷是一種由多種肝臟炎癥性疾病所引起的肝臟損傷，其具體的致病因素包括炎癥因子的釋放、活性氧自由基的激活、氧化應激損傷以及線粒體功能障礙。Tan ⅡA具有顯著的抗炎及抗氧化作用，可保護肝細胞，減輕肝臟損傷，如Tan ⅡA可通過下調(diào)炎性介質(zhì)高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)蛋白和mRNA表達，抑制細胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等其他炎癥因子的釋放，繼而減輕大鼠肝細胞損傷[1]；也可通過作用于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白促進肝細胞對HMGB1的攝取作用，從而降低肝損傷[2]。此外，Tan ⅡA能夠通過抑制炎癥相關信號通路，減少炎癥細胞的活化，如通過下調(diào)p38和NF-κB表達，抑制促炎因子白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6和TNF-α的釋放，減輕肝臟的損傷[3]。

正常情況下，細胞氧化與抗氧化能力處于平衡狀態(tài)，過量的氧自由基可破壞生物膜而導致脂質(zhì)過氧化，是肝損傷的重要原因之一。Tan ⅡA具有良好的抗氧化應激作用，有明顯的肝臟細胞保護作用。在雷公藤內(nèi)酯醇與對乙酰氨基酚誘導的大鼠急性肝損傷模型中，Tan ⅡA處理可顯著增強肝細胞活力并改善肝功能指標，降低大鼠肝細胞中的丙二醛活性，提高其超氧化物歧化酶及過氧化氫酶的含量[4-5]。此外，Tan ⅡA可抑制乙醇誘導的肝細胞氧自由基的產(chǎn)生，減少細胞內(nèi)活性氧的生成，可能與其激活孕烷X受體而誘導肝臟中代謝酶CYP3A表達有關[6]。

1.2 Tan ⅡA在肝纖維化中的作用肝臟發(fā)生持續(xù)性損傷時，刺激細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的生成和降解平衡失控，過多的ECM聚集在肝臟內(nèi)，重塑肝臟的組織結構，形成纖維瘢痕，導致肝纖維化。肝臟中主要產(chǎn)生ECM的細胞是肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)，其在激活后轉(zhuǎn)化為表達α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細胞。目前認為，HSC的激活是肝纖維化發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的活化和促進其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效途徑之一。

在各種致病因素的作用下，細胞因子可通過多種信號轉(zhuǎn)導途徑激活HSC。NF-κB信號通路是經(jīng)典的通路之一，可通過促進多種細胞因子分泌，誘導HSC活化，因此阻斷其信號轉(zhuǎn)導則可抑制HSC的激活。Tan ⅡA預處理脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的大鼠HSC，可明顯抑制HSC中NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)位及蛋白表達，減弱炎癥因子表達，從而保護肝細胞[7]。除了NF-κB信號通路，Tan ⅡA還能夠阻斷TGF-β1/Smad3信號通路，減少HSC中的TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA的表達，抑制MAPK信號通路，從而抑制HSC的活化[7-9]。

HSC激活過程很難被逆轉(zhuǎn)，促進其凋亡也是減少HSC活化的主要方式。在肝纖維化恢復期，活化HSC的清除主要依賴于其凋亡。Tan ⅡA可以激活ERK-Bax-caspase途徑，釋放線粒體細胞色素C，誘導caspase-3裂解，上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白比例，同時抑制Akt的磷酸化，從而促進HSC凋亡[10]；也可通過改變細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E來誘導活化HSC中S期細胞周期停滯，促進細胞凋亡[11]。

1.3 Tan ⅡA在非酒精性脂肪肝中的作用非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝臟損傷，其臨床病理的主要特征是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關肝硬化。

NAFLD最初表現(xiàn)為脂肪變性，在炎癥因子誘導下進一步發(fā)展成NAFLD。Tan ⅡA衍生的水溶性化合物丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate, STS)可通過降低TNF-α、TGF-β1以及IL-1的轉(zhuǎn)錄，抑制油酸和棕櫚酸處理的人肝癌細胞HepG2和原代永生化人肝細胞中的炎癥反應和脂質(zhì)積累，減輕肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積[12]。對高脂血癥大鼠，Tan ⅡA可通過調(diào)節(jié)肝臟低密度脂蛋白受體、肝臟固醇反應元件結合蛋白-2以及相關膽固醇基因的表達；還能夠通過調(diào)節(jié)miR-33a和SREBP-2/Pcsk9信號通路蛋白來減輕高脂血癥大鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積[13-14]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是一類核受體，可介導脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，已成為治療NAFLD的關鍵靶點，活化的PPARγ調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的相關基因表達，促進脂肪酸儲存，其過表達可誘導肝臟脂質(zhì)積累。

1.4 Tan ⅡA在肝癌中的作用肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤，其發(fā)病機制復雜，與多種信號通路都有密切關系。在人肝癌HepG2細胞中，Tan ⅡA可通過miR30b-p53-PTPN11/SHP2信號途徑來誘導肝癌細胞的死亡[15]；也能夠降低金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達，阻斷NF-κB的活化而抑制HCC細胞在體外和體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

凋亡在肝癌細胞中也起著重要角色。在體外，Tan ⅡA可以通過阻滯細胞周期于G2/M期和G0/G1期，抑制人肝細胞癌細胞系的增殖[17-18]。Tan ⅡA處理HepG2細胞后，半胱天冬酶-8形成同型二聚體，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶裂解，RIP1/RIP3復合物引起了細胞壞死性凋亡，表明Tan ⅡA可引起細胞壞死性凋亡[19]。

多項研究也證實，Tan ⅡA與其他藥物同時應用還可發(fā)揮協(xié)同作用。Tan ⅡA可加強P-糖蛋白的表達，抑制多柔比星在HCC細胞中的流出[20]。同樣，Tan ⅡA可與反式白藜蘆醇結合而發(fā)揮協(xié)同作用，產(chǎn)生與順鉑相當?shù)募毎拘?，使細胞周期停滯G1期和DNA片段化，誘導HepG2和HCC細胞凋亡[21]。

2 Tan ⅡA在肝臟疾病中新劑型的研究

由于Tan ⅡA對肝臟疾病具有明顯的治療效果，為克服其口服吸收生物利用度低，以及水溶性差的缺點，研究者們嘗試Tan ⅡA的多種新劑型，以提高Tan ⅡA的生物利用度，降低不良反應，達到更好的藥效。

2.1 納米顆粒納米技術是一種增加藥物溶解度的有用方法，攜藥納米顆粒靶向治療疾病已經(jīng)取得巨大進步，但由于生物可降解性、免疫相容性、生物利用度和生物相容性等原因，常選用蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)作為遞送藥物的載體[22]。

將血紅蛋白中的珠蛋白溶液加入到Tan ⅡA乙醇溶液中可獲得Tan ⅡA負載珠蛋白納米顆粒(TA-Gb-NPs)，該納米顆粒增加了Tan ⅡA的水溶性，具有良好的肝臟靶向能力，使藥物在肝臟中有更高的濃度和更長的保留時間，能顯著改善硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化，可成為治療肝纖維化的藥物載體[23]。以水包油乳液/溶劑蒸發(fā)方法可得到Tan ⅡA聚乳酸納米顆粒(TS-PLA-NPs)，對人肝癌細胞的生長抑制作用具有濃度和時間依賴性，可預防小鼠腫瘤生長、延長肝癌小鼠存活時間[24]。而負載在甲氧基聚乙二醇，聚乳酸-乙醇酸，聚L-賴氨酸和環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸中的Tan ⅡA納米顆粒(TNPs)可用于治療體內(nèi)外肝細胞癌，穩(wěn)定性較好，并具有均勻的尺寸分布，可延長Tan ⅡA釋放的時間并提高腫瘤靶向活性[25]，是一種新型靶向治療肝癌的載藥系統(tǒng)。

2.2 聚合物膠束聚合物膠束由于其高載藥量和體內(nèi)長期循環(huán)而成為一種有前途的藥物遞送載體。傳統(tǒng)的聚合膠束特異性差、生物安全性低，可設計具有多功能的載藥膠束。

將甘草次酸(GA)與聚乙二醇-二硫化物鍵的聚乳酸共乙醇酸偶聯(lián)，可得到雙官能團可生物降解的膠束體系(GA-PEG-SS-PLGA)，實現(xiàn)肝癌靶向和氧化還原反應性細胞內(nèi)藥物釋放。Tan ⅡA封裝于多功能膠束后，表現(xiàn)出在肝臟快速聚集和更快的藥物釋放，上調(diào)細胞內(nèi)ROS水平，誘導細胞周期停滯在S期，上調(diào)凋亡蛋白caspase-3、p38蛋白的表達，促進細胞凋亡，在小鼠腫瘤模型中具有更強的抗腫瘤作用，說明該聚合膠束是一種新的Tan ⅡA遞送系統(tǒng)，有望用于肝癌的治療[26]。

2.3 固體分散體固體分散體是一種將藥物高度分散在固體載體中形成的固體分散系統(tǒng)，一般粒徑為1～100 μm，固體分散體可以將液態(tài)藥物固態(tài)化，以掩蓋藥物的不良氣味，可緩慢釋放藥物，減慢藥物的水解以及氧化。

多孔二氧化硅的表面上具有許多硅烷醇基團，可以用作藥物賦形劑，用多孔二氧化硅制備的固體分散體可以改善藥物的溶出速率和穩(wěn)定性。體外溶出研究中，Tan ⅡA與多孔二氧化硅以1 ∶8的比例混合制備的固體分散體，能夠表現(xiàn)出顯著改善體外溶出速率，在室溫條件下儲存12個月，藥物溶出略有下降，但能保持物理穩(wěn)定性。生物利用度實驗中，固體分散體的Tan ⅡA表現(xiàn)出更快的吸收速率和更高的生物利用度[27]。

2.4 脂質(zhì)體脂質(zhì)體屬于靶向遞藥系統(tǒng)的一種新劑型，以磷脂為膜材分散在水中，形成脂質(zhì)雙分子層，具有良好的生物相容性。通過表面修飾，脂質(zhì)體可聚集于特定組織部位，如脂質(zhì)體因被動靶向作用而分布于內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的組織[28]。

以新型甘草次酸衍生物——甘氨酸丁二酸甘草次酸十八烷酯為配體，采用薄膜分散-高壓乳勻法制備Tan ⅡA脂質(zhì)體，經(jīng)尾靜脈給藥后，測定小鼠在不同時間點血漿樣本，以及小鼠的心、肝、脾、肺、腎組織樣本中Tan ⅡA的含量。結果顯示Tan ⅡA脂質(zhì)體的粒徑、電位、包封率、配體結合率均符合要求，且能夠增加其在肝組織的峰濃度，表明該Tan ⅡA脂質(zhì)體具有良好的肝靶向性作用。

3 總結與展望

本文簡要地綜述了Tan ⅡA在肝臟疾病方面的保護作用及其新劑型的研究現(xiàn)狀，隨著Tan ⅡA體內(nèi)、體外及臨床試驗的深入研究，進一步研究其作用機制對擴大臨床應用范圍和提高其有效性具有重要意義。

目前，Tan ⅡA在肝病中的作用研究主要集中在其治療肝臟損傷和肝癌作用上，對于抗肝纖維化的研究相對較少，而肝纖維化是各種慢性肝病的必要途徑，進一步研究Tan ⅡA在肝纖維化中的作用具有重要的意義。此外，大多數(shù)研究對象僅限于離體培養(yǎng)的肝細胞，以及嚙齒動物模型，對其作用機制的研究相對較少且比較淺顯。為確保Tan ⅡA臨床使用的安全性和有效性，需要進行大規(guī)模的隨機臨床試驗和進一步的科學研究，以揭示Tan ⅡA的作用機制，也有利于推廣Tan ⅡA作為治療肝病的替代藥物。

提高Tan ⅡA的水溶性并增加其在血漿中的濃度具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，良好的載藥體系可增加Tan ⅡA在肝組織中的濃度，部分解決其口服吸收差，生物利用度低以及體內(nèi)消除快的缺點，但是仍有一些問題有待解決。新載體材料的開發(fā)仍具有重要意義，如開發(fā)粒徑小，無毒，生物降解性和生物相容性好，在血液循環(huán)中穩(wěn)定，能夠穿過血腦脊液屏障，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的吞噬，并能在血液循環(huán)中保留較長時間的材料，以進一步提高Tan ⅡA治療肝臟疾病的作用。

總之，隨著研究人員對Tan ⅡA在肝病學中作用機制的研究，優(yōu)良制備技術的開發(fā)，有效衍生物的研制，Tan ⅡA在肝臟疾病中的應用將得到更廣泛的認可，使其在臨床上具有廣闊的應用前景。