王勝玉，梁鵬，段立廣，喬曉強(qiáng)

(1. 河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

固定相是高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)的核心部件.為了滿足不同領(lǐng)域日益增長的分離分析需求，研究者發(fā)展了多種類型的色譜固定相材料[1-2].目前，混合模式固定相已經(jīng)成為色譜研究的一個(gè)熱門課題.混合模式固定相與傳統(tǒng)的單一分離模式固定相相比，具有高選擇性、高分離效率和高樣品載樣量等優(yōu)點(diǎn)[3-4].已有文獻(xiàn)報(bào)道了多種類型的混合模式固定相，并將其應(yīng)用于小分子和大分子的分離，如反相液相色譜/親水相互作用液相色譜(RPLC/HILIC)[5-7]，RPLC/離子交換色譜(IEC)[8-9]，HILIC/IEC[10-12]和RPLC/HILIC/IEC[13-14].然而，開發(fā)新的混合模式固定相以應(yīng)對(duì)不斷發(fā)展的分析和工業(yè)應(yīng)用挑戰(zhàn)具有十分重要的意義.

在各種混合模式固定相中，HILIC/RPLC混合模式固定相由于其優(yōu)異的正交性和互補(bǔ)性，應(yīng)用最為廣泛.如利用不同極性的官能團(tuán)對(duì)二氧化硅材料表面進(jìn)行改性而發(fā)展的HILIC/RPLC混合模式固定相備受關(guān)注，目前文獻(xiàn)報(bào)道的官能團(tuán)有芳香咪唑基[15]、季銨[15-18]、極性酰胺[19-20]、苯胺[21]、偶氮苯[22]、多糖[23]和羥基[24-25]等.

離子液體(ILs)具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和溶解特性，這賦予了離子液體修飾的固定相更多的優(yōu)勢(shì)[15-16, 18, 26].其中咪唑類ILs已被廣泛應(yīng)用于混合模式固定相的制備[27].例如，Zhang等制備了咪唑啉固定化硅球修飾色譜固定相，并在HILIC和RPLC模式下實(shí)現(xiàn)了多種水溶性維生素和芳香族化合物的分離[17].在前期研究工作中[15-16, 28]，筆者發(fā)展了多種新型的基于咪唑型離子液體的改性固定相，其展示出的HILIC/RPLC混合模式機(jī)制為分離和分析不同種類和性質(zhì)的物質(zhì)提供了良好的選擇.

為了進(jìn)一步豐富HILIC/RPLC固定相并擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，本研究利用“點(diǎn)擊化學(xué)”的方法引入咪唑嵌合離子液體和L-半胱氨酸(Cys)，制備了新型功能化硅膠色譜固定相(SIL-AVI-Cys).對(duì)所制備的固定相進(jìn)行紅外分析、元素分析和熱重分析等表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咪唑嵌合L-半胱氨酸已成功鍵合于硅球表面.填充SIL-AVI-Cys色譜柱展示了混合模式RPLC/HILIC機(jī)制及良好的分離性能，并將SIL-AVI-Cys色譜柱應(yīng)用到奶粉中潛在添加三聚氰胺的檢測(cè)和表征.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

5 μm球形硅膠(孔徑10 nm)購自富士硅化學(xué)株式會(huì)社(日本)；Cys購自阿法埃莎(北京)；(3-巰丙基)三甲氧基硅烷(MPS)購自阿拉丁(上海)；1-烯丙基-3-乙烯基咪唑溴鹽(AVI)購自華威銳科(北京)；偶氮二異丁腈(AIBN)購自伊諾凱(北京).

FT-IR實(shí)驗(yàn)于Bruker公司(德國)的VERTEX70光譜儀中完成；熱重分析實(shí)驗(yàn)于Perkin-Elmer公司(美國)的TGA/SDTA851E系統(tǒng)中完成；元素分析由加聯(lián)儀器公司(美國)的CE-440系統(tǒng)完成；高效液相色譜實(shí)驗(yàn)由大連依利特分析儀器有限公司的P230Ⅱ系統(tǒng)完成；填充色譜柱由無錫加萊克色譜科技有限公司的GLK100型裝柱系統(tǒng)完成.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SIL-AVI-Cys固定相的制備

SIL-AVI-Cys固定相的制備路線如圖1所示.

第1步，MPS修飾硅球(SIL-MPS)的制備：參考文獻(xiàn)[29]中合成方法，取3.0 g硅球加入到50 mL的燒瓶中，再加入無水甲苯25 mL使其充分懸浮，然后緩慢將3.1 mL MPS加入，攪拌使其混合均勻，充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在110 ℃條件下回流反應(yīng)24 h.反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物冷卻到室溫，分別用甲苯、體積比1∶1的甲醇-水和甲醇洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并于真空干燥箱中60 ℃干燥8 h后，可用于進(jìn)一步后續(xù)修飾.

第2步，AVI修飾固定相(SIL-AVI)的合成：將3.0 g制備的SIL-MPS混懸于30 mL的氯仿中，并加入200 mg的AIBN作為催化劑，攪拌均勻，于60 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h.待反應(yīng)停止后冷至室溫，分別用氯仿、體積比1∶1的甲醇-水和甲醇洗滌反應(yīng)產(chǎn)物.反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)真空干燥12 h后，可用于進(jìn)一步后續(xù)修飾.

第3步，Cys修飾固定相(SIL-AVI-Cys)的制備:稱取3.0 g SIL-AVI，加入40 mL體積比為1∶2的甲醇-水溶液和1.0 g Cys，繼續(xù)加入160 mg 的AIBN，于60 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h.待反應(yīng)停止后冷至室溫，分別用體積比為1∶2的甲醇-水、甲醇洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，于真空干燥箱中50 ℃下干燥12 h，即得SIL-AVI-Cys固定相.

圖1 咪唑嵌合半胱氨酸功能化色譜固定相制備示意

1.2.2 色譜柱填充及分離條件

色譜柱填充步驟：取2.2 g的SIL-AVI-Cys固定相，懸浮于20 mL體積比為1∶1的三氯甲烷-環(huán)己醇勻漿液中，超聲混懸均勻.然后將混懸液緩慢倒入勻漿管中，連接裝柱系統(tǒng)，并采用體積比為1∶1的異丙醇-甲醇為加壓液，在40 MPa壓力下裝填約30 min后釋放壓力.靜置約20 min之后將色譜柱取下，連接液相色譜系統(tǒng)，并以乙腈為流動(dòng)相，在1.0 mL/min流速下沖洗色譜柱80 min后即可使用.

色譜分離條件：所制備的SIL-AVI-Cys色譜柱和氨基柱均在等梯度下進(jìn)行分離測(cè)試.流速采用1 mL/min，柱溫采用室溫.核苷和核酸堿基類化合物分離采用流動(dòng)相為體積比92∶8的乙腈-水，波長為254 nm；酰胺類化合物分離時(shí)采用流動(dòng)相為體積比98∶2的乙腈-水，波長為214 nm；三聚氰胺和奶粉樣品分離采用流動(dòng)相為體積比90∶10的乙腈-水，波長為240 nm.上述樣品均使用初始流動(dòng)相溶解并配制為200～500 μg/mL的溶液，進(jìn)樣體積為5 μL.

1.2.3 奶粉樣品制備

奶粉樣品制備參考文獻(xiàn)[30].取0.4 g的奶粉加入到5 mL體積分?jǐn)?shù) 1%的甲酸溶液當(dāng)中，混合均勻后緩慢加入乙腈至總體積為10 mL，并于15 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液收集，并采用0.22 μm濾膜過濾之后，待分析使用.

2 結(jié)果與討論

2.1 SIL-AVI-Cys材料表征

SIL-AVI-Cys材料首先利用FT-IR光譜儀進(jìn)行表征，其結(jié)果歸納如圖2.在空硅球Silica的譜圖中，可觀測(cè)到980 cm-1特征吸收峰，為硅醇基特征吸收；經(jīng)MPS修飾之后，980 cm-1峰消失，可驗(yàn)證MPS被成功修飾到了硅球表面；SIL-AVI譜圖中，在1 560 cm-1處出現(xiàn)咪唑基團(tuán)上C=C伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，在960 cm-1處出現(xiàn)咪唑側(cè)鏈烯烴C—H面外彎曲振動(dòng)特征吸收峰，可驗(yàn)證AVI被成功鍵合到了硅球表面.

固定相的熱重分析結(jié)果如圖3所示.在100 ℃左右，空硅球的質(zhì)量損失約為2.0%，這是由于在硅球表面吸附的水分子隨溫度的升高蒸發(fā)所致；與裸硅球相比，SIL-MPS在200～800 ℃的質(zhì)量損失約為4.6%，SIL-AVI及SIL-AVI-Cys固定相與裸硅球相比質(zhì)量損失分別為14%和24%，這是由于固定相上鍵合了咪唑和半胱氨酸基團(tuán).因?yàn)楣潭ㄏ?00 ℃以上時(shí)的質(zhì)量損失一般是由于其表面存在的有機(jī)官能團(tuán)丟失導(dǎo)致的，上述結(jié)果證明所制備的固定相具有較高的熱穩(wěn)定性，也進(jìn)一步表明SIL-AVI-Cys固定相已被成功制備.

圖2 紅外光譜表征Silica、SIL-MPS、SIL-AVI和SIL-AVI-Cys色譜固定相

圖3 熱重分析表征Silica、SIL-MPS、SIL-AVI和SIL-AVI-Cys色譜固定相

進(jìn)一步使用元素分析對(duì)材料進(jìn)行表征，結(jié)果顯示SIL-MPS中C、H和N元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次分別為3.7%、1.2%和小于0.3%；SIL-AVI中3種元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加到10.9%、1.7%和2.5%，元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加表明AVI已成功鍵合到硅膠表面；SIL-AVI-Cys色譜固定相中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可進(jìn)一步增至12.7%、2.1%和3.1%.以上元素分析結(jié)果可證實(shí)咪唑以及半胱氨酸均被成功地修飾到了硅球表面.

2.2 保留機(jī)制

SIL-AVI-Cys色譜柱保留機(jī)制首先使用胞核嘧啶、尿嘧啶、胞苷、尿苷和肌苷等5種親水性物質(zhì)進(jìn)行了考察.當(dāng)流動(dòng)相中水的含量增加時(shí)，上述核苷和核酸堿基類化合物在SIL-AVI-Cys色譜柱中保留逐漸減弱(圖4)，尤其是當(dāng)流動(dòng)相中水的體積分?jǐn)?shù)從10%增加至25%時(shí)，上述物質(zhì)的保留迅速降低，表明SIL-AVI-Cys固定相與強(qiáng)極性物質(zhì)存在親水作用，顯示親水作用色譜保留特征.

SIL-AVI-Cys色譜柱保留機(jī)制進(jìn)一步采用苯酚和苯胺類化合物進(jìn)行了考察.從圖5可看出，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)在50%～70%時(shí)，苯酚和苯胺類化合物保留因子(k)隨著流動(dòng)相乙腈含量增加而逐漸減弱，顯示反相色譜保留機(jī)制；隨著流動(dòng)相乙腈體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，苯酚和苯胺類化合物的保留開始逐漸增加，表明該色譜柱同時(shí)顯示親水色譜保留機(jī)制.通過以上考察分析，筆者制備的SIL-AVI-Cys固定相具有親水/反相混合模式，但以親水模式為主，這主要是由于SIL-AVI-Cys固定相表面具有大量的羧基和氨基，容易和流動(dòng)相中的水分子相互作用，形成“水膜”層，易于和極性化合物產(chǎn)生強(qiáng)相互作用.

圖4 流動(dòng)相水體積分?jǐn)?shù)對(duì)核苷/核酸堿基類物質(zhì)保留影響

圖5 流動(dòng)相乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)苯胺和苯酚類化合物保留影響

2.3 pH及鹽濃度對(duì)色譜保留影響

在親水作用色譜中，流動(dòng)相的pH值變化和鹽濃度會(huì)對(duì)分析物保留產(chǎn)生重要的影響.于是筆者探討了流動(dòng)相的pH值及其鹽濃度對(duì)物質(zhì)保留的影響.pH值對(duì)分析物保留影響如圖6.中性和堿性物質(zhì)受pH值影響較小，這是由于pH值的變化對(duì)其離子化程度影響較小.對(duì)于酸性的苯甲酸(pKa= 4.17)，其保留隨著流動(dòng)相pH值的增加而逐漸增強(qiáng)，尤其是在pH值高于4時(shí)，其保留明顯增加，這主要是因?yàn)樵诟遬H值流動(dòng)相系統(tǒng)中，苯甲酸逐漸從分子狀態(tài)離子化，和固定相產(chǎn)生強(qiáng)的靜電相互作用，故保留增加.

流動(dòng)相中鹽濃度變化對(duì)物質(zhì)保留的影響如圖7所示.對(duì)于酸性化合物苯甲酸和1-羥基-2-萘酸，物質(zhì)的保留隨著流動(dòng)相中鹽濃度的增加逐漸降低，原因可能是隨著流動(dòng)相中鹽濃度的逐漸增加，流動(dòng)相中離子強(qiáng)度增加，使保留減弱.然而，對(duì)中性和堿性物質(zhì)而言，如煙堿、肌苷、胞核嘧啶和三聚氰胺，其保留變化不明顯.

色譜條件：含10 mmol/L甲酸銨的乙腈-水(體積比85∶15)為流動(dòng)相，甲酸調(diào)節(jié)pH；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長分別為煙堿：272 nm，苯甲酸：230 nm，肌苷和胞核嘧啶：254 nm，三聚氰胺：240 nm

色譜條件：含不同濃度甲酸銨的乙腈-水(體積比85∶15)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長分別為煙堿：272 nm，三聚氰胺：240 nm，苯甲酸和1-羥基-2-萘酸：230 nm，肌苷和胞核嘧啶：254 nm

2.4 色譜分離性能

采用核苷及核酸堿基、酰胺類化合物考察了SIL-AVI-Cys色譜柱的分離效果，并和商品化的氨基柱分離效果進(jìn)行了比較.

2.4.1 核苷和核酸堿基分離效果

首先使用核苷和核酸堿基類化合物評(píng)價(jià)所制備的SIL-AVI-Cys色譜柱的分離性能，并與氨基柱進(jìn)行了對(duì)比.如圖8a和8b所示，以體積比為92∶8的乙腈-水為流動(dòng)相，4種化合物在SIL-AVI-Cys色譜柱和商品化氨基柱上均實(shí)現(xiàn)了分離，但是在氨基柱上所需分離時(shí)間較長.如圖8c所示，進(jìn)一步提高流動(dòng)相中水的體積分?jǐn)?shù)到11%，可以縮減肌苷在氨基柱上的保留，但造成了尿苷、腺苷和尿嘧啶分離度的降低.此外，在SIL-AVI-Cys色譜柱上，尿苷和腺苷洗脫順序與其在氨基柱中相反，這說明SIL-AVI-Cys色譜柱與商品化氨基柱具有不同的分離選擇性，原因可能是咪唑環(huán)提供了較強(qiáng)的π-π和疏水相互作用.

色譜條件：圖a、b使用流動(dòng)相為乙腈-水(體積比92∶8)，圖c使用流動(dòng)相為乙腈-水(體積比89∶11)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；分析物：1. 尿嘧啶；2. 腺苷；3. 尿苷；4. 肌苷.

2.4.2 酰胺類物質(zhì)分離效果

酰胺類化合物在SIL-AVI-Cys色譜柱中的分離效果如圖9a所示，選用體積比為98∶2的乙腈-水為流動(dòng)相，雙丙烯酰胺、丙二酰胺、煙堿和硫代乙酰胺可實(shí)現(xiàn)快速分離，且具有較高柱效；同樣，4種物質(zhì)在商品化氨基柱上也可實(shí)現(xiàn)快速有效分離，說明SIL-AVI-Cys色譜柱具有與商品化氨基柱相當(dāng)?shù)姆蛛x性能.

2.5 檢測(cè)奶粉樣品中的三聚氰胺

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，由于其高含氮量特征，經(jīng)常被不法分子作為乳制品添加劑，以提高乳制品蛋白的顯性含量.但是，三聚氰胺聚集在人體可引發(fā)腎功能衰竭等多種疾病.筆者發(fā)展了基于SIL-AVI-Cys固定相的奶粉樣品中三聚氰胺的檢測(cè)方法.圖10a和10b依次是三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品以及奶粉樣品在SIL-AVI-Cys色譜柱上的分離譜圖.從圖中可發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺在SIL-AVI-Cy色譜柱上具有較強(qiáng)的保留；在當(dāng)前的色譜檢測(cè)條件下，未在奶粉樣品中檢出三聚氰胺.綜上所述，筆者發(fā)展的SIL-AVI-Cys色譜柱有望用于檢測(cè)和表征乳制品中非法添加的三聚氰胺.

色譜條件：流動(dòng)相采用乙腈-水(體積比98∶2)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為214 nm；分析物：1. 硫代乙酰胺；2. N,N-亞甲基雙丙烯酰胺；3. 煙酰胺；4. 丙二酰胺

色譜條件：流動(dòng)相采用乙腈-水(體積比90∶10)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為240 nm.

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)并合成了咪唑嵌合半胱氨酸修飾固定相SIL-AVI-Cys.所制備的SIL-AVI-Cys材料具有親水/反相混合模式的保留特征.核苷及核酸堿基類物質(zhì)、酰胺類化合物均可在SIL-AVI-Cys色譜柱上實(shí)現(xiàn)有效分離分析，具有良好的分離性能.此外，SIL-AVI-Cys色譜柱還可實(shí)現(xiàn)奶粉中添加三聚氰胺的有效檢測(cè)和表征.