周柯巖,楊瑜濤, 李華肖, 李瑋

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 教育部藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

硫醇是一種含有巰基官能團(tuán)的一類非芳香族化合物.其中小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，它們?cè)谏矬w內(nèi)參與多種生理活動(dòng)，在蛋白質(zhì)的合成、氧化還原、細(xì)胞的抗氧化等重要的生理過程中發(fā)揮著重要作用[1].作為一種可以天然產(chǎn)生的氨基酸——半胱氨酸(Cys)，其具有刺激造血機(jī)能，促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的作用[1-2]，細(xì)胞內(nèi) Cys 的缺失，會(huì)造成肝臟損傷、毛發(fā)減少褪色等等.人體中一個(gè)非常重要的中間代謝產(chǎn)物——高半胱氨酸(Hcy)，其在人體中的含量大于 10 μmol/L 則會(huì)表現(xiàn)為臨床異常[3-8]，含量過高會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心血管病、骨軟弱癥、精神疾病等等.細(xì)胞內(nèi)含量最高的一種硫醇——谷胱甘肽(GSH)，可以參加多種機(jī)體的生化反應(yīng)，其在免疫方面發(fā)揮著重要作用[9]，其含量與衰老、過敏、腫瘤、脂肪肝、艾滋病等有著重要的聯(lián)系. 近年來，用來檢測(cè)生物硫醇類的小分子熒光探針受到了廣泛關(guān)注.小分子生物硫醇的熒光探針的檢測(cè)主要基于親核加成反應(yīng)[10-13]、斷鍵分解反應(yīng)[14-16]、金屬絡(luò)合物置換配位反應(yīng)[17]等反應(yīng)機(jī)理.本文成功設(shè)計(jì)并合成了一種基于色烯衍生物的熒光探針 1，該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物硫醇的快速、高靈敏度和高選擇性的“關(guān)”-“開”型熒光信號(hào)響應(yīng).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

ZF-20D 暗箱式紫外分析儀，600Hz 核磁共振儀(Bruker)，Agilent Technologies Cary 60紫外-可見分光光度計(jì)，Agilent Technologies Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)，Agilent Technologies 質(zhì)譜儀.

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

1.2 溶液配制及光譜測(cè)定

用 DMF 制備探針的儲(chǔ)備液，配制溶度為 2×10-3mol/L，各種氨基酸和陰離子均用去離子水配制，濃度為 2×10-3mol/L.紫外和熒光光譜在 PBS-DMF(10 mmol/L，體積比1∶1，pH=7.4)中檢測(cè)獲得，熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為 395 nm，光柵狹縫 5 nm /5 nm，電壓為 600 V 條件下獲得.

1.3 熒光探針的制備與表征

熒光探針的合成路線見圖1.

化合物2∶5-氯-2-羥基-1，3-(亞苯基)二甲醇；化合物3∶5-氯-2-羥基-3-(羥甲基)苯甲醛；化合物4∶色烯衍生物.

1.3.1 化合物4(色烯衍生物)的合成

將化合物3(0.372 g，2 mmol)、環(huán)戊烯酮(0.164 g，4 mmol)以及咪唑(0.136 g，2 mmol)加入到圓底燒瓶中，用溶劑V(THF)∶V(H2O)=1∶1進(jìn)行溶解，在 30 ℃下緩慢攪拌 72 h，點(diǎn)板監(jiān)測(cè)，直至反應(yīng)完畢，得到深棕色溶液.用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，通過真空濃縮，除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE)∶V(EA)=2∶1)分離得到黃色固體(0.25 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%).

1.3.2 化合物3(5-氯-2-羥基-3-(羥甲基)苯甲醛)的合成

將化合物2(20 g，106 mmol)和二氧化錳(20 g，230 mmol)加入到圓底燒瓶中，將其溶解于 300 mL 氯仿中，在0 ℃下攪拌反應(yīng) 1 h，點(diǎn)板監(jiān)測(cè)，直至反應(yīng)完畢. 將反應(yīng)液通過真空過濾，收集濾液，將其真空干燥，除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE) ∶V(EA)=15∶1)分離得到白色晶體(11.04 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)56%).

1.3.3 化合物2((5-氯-2-羥基-1、3-(亞苯基)二甲醇)苯甲醛的合成

將氫氧化鈉(6 g，150 mmol)溶解在 20 mL 水中，向其溶液中加入對(duì)氯苯酚(19 g，150 mmol)，緩慢攪拌至溶解，且溶液變?yōu)榻瘘S色，再向其中加入多聚甲醛(9 g，300 mmol)，加熱到 50 ℃，反應(yīng) 1 h，至有黃色固體產(chǎn)生，停止反應(yīng)，將其溶解于熱水100 mL中，用HCl調(diào)至 pH 1～2，真空過濾，真空干燥，得到淺黃色固體(26.89 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%).

1.3.4 探針1的合成

將化合物4(0.32 g，1.5 mmol)和氧化劑 PCC(0.32 g，1.5 mmol)，溶解于二氯甲烷中，室溫?cái)嚢?，點(diǎn)板監(jiān)測(cè)，直至反應(yīng)完畢，停止反應(yīng)，真空濃縮除去溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE)∶V(EA)=7∶1)得到黃色固體(0.11g，46%質(zhì)量分?jǐn)?shù)).探針的核磁表征如圖2.1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：10.40(s，1H)，7.76(d，J=2.5 Hz，1H)，7.4(d，J=2.5 Hz，1H)，7.14(d，J=2.4 Hz，1H)，5.42～5.39(m，1H)，2.83～2.78(m，1H)，2.69～2.64(m，1H)，2.44～2.37(m，1H)，2.28～2.21(m，1H)，13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：200.3，187.2，155.9，135.0，133.4，129.6，127.8，125.3，125.1，124.6，76.4，36.9，27.9.

1H NMR(CDCl3，600 MHz)；13C NMR(CDCl3，150 MHz).

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1對(duì)生物硫醇的光譜研究

首先，筆者進(jìn)行了探針 1 識(shí)別生物硫醇的滴定光譜研究，在含有探針 1 (50 μmol/L) 的PBS-DMF(體積比1∶1，pH 7.4，10 mmol/L)緩沖體系中展開，以 GSH 為例進(jìn)行研究.如圖3a 所示，將 GSH 加入到探針 1 的溶液中，隨著 GSH 的加入，最大吸收峰的波長(zhǎng)不斷增加，直至加入50 μmol/L當(dāng)量的 GSH，最大吸收峰的波長(zhǎng)不再增加.此時(shí)，最大吸收峰的波長(zhǎng)發(fā)生了 47 nm的紅移.如圖 3b 所示，是與之相對(duì)應(yīng)的熒光滴定光譜，探針 1 對(duì)生物硫醇有較強(qiáng)的響應(yīng)，隨著 GSH(50 μmol/L)的加入，在 514 nm 處的熒光強(qiáng)度不斷增加.與空白體系相比，飽和體系的熒光強(qiáng)度是空白體系的 56 倍.

2.2 探針1對(duì)識(shí)別生物硫醇的選擇性研究

圖4 探針1對(duì)生物硫醇的(a)紫外-可見吸收光譜選擇性實(shí)驗(yàn)和(b)熒光光譜選擇性實(shí)驗(yàn)

2.3 探針1對(duì)生物硫醇檢出限的研究

筆者根據(jù)探針 1 對(duì) GSH 的熒光光譜數(shù)據(jù)分析計(jì)算得出檢出限.首先通過對(duì)探針1溶液(50 μmol/L)掃描 10 次，測(cè)定其在 514 nm 處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，然后通過探針1在不同濃度的 GSH 在 514 nm 處熒光強(qiáng)度與 GSH 濃度的做出工作曲線，其線性方程為Y=14.583 87c(GSH)+30.372 53，R2為 0.990 02，根據(jù)檢出限計(jì)算公式 3σ/k、經(jīng)過計(jì)算得出探針1對(duì)GSH的檢出限低達(dá)0.12 μmol/L，表明探針1對(duì)生物硫醇的檢測(cè)有較高的靈敏度(圖 5).

2.4 探針1對(duì)生物硫醇的動(dòng)力學(xué)研究

筆者進(jìn)行了探針1與生物硫醇的動(dòng)力學(xué)研究，以GSH為例進(jìn)行研究.如圖 6 所示，探針1(50 μmol/L)溶液中加入GSH(50 μmol/L)后，熒光強(qiáng)度明顯增加，直到 2 min 后不再增加. 結(jié)果表明，探針1能夠快速檢測(cè)生物硫醇.

圖5 514 nm處熒光強(qiáng)度與不同濃度GSH的工作曲線

圖6 探針1與GSH的反應(yīng)時(shí)間

2.5 探針1的pH研究

研究了 pH 對(duì)探針 1 識(shí)別生物硫醇的影響，選擇不同(3～12)pH 的PBS-DMF(體積比1∶1，10 mmol/L)作為緩沖條件，以GSH為例進(jìn)一步展開.如圖7所示，探針1本身在pH處于3～10內(nèi)，探針基本維持不變；而加入GSH后，pH在6～12內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加. 結(jié)果表明，探針 1 對(duì)生物硫醇的響應(yīng)可以在較寬的范圍內(nèi)進(jìn)行.

圖7 pH對(duì)探針1識(shí)別 GSH 的影響

3 總結(jié)

成功合成一種色烯衍生物類的小分子熒光探針 1 用于生物硫醇的選擇性檢測(cè).通過核磁對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并且紫外可見光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)表明，該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物硫醇的快速檢測(cè)(2 min)，檢測(cè)限為 0.12 μmol/L. 因此，探針 1 可對(duì)細(xì)胞中的硫醇濃度進(jìn)行檢測(cè).